DB35T 1354-2013罗非鱼无乳链球菌病双重PCR 诊断规程.docxVIP

ICS 65.150 B 52 福 建 省 地 DB35 方 标 准 DB35/T 1354—2013 罗非鱼无乳链球菌病双重 PCR 诊断规程 Diagnostic protocols of tilapia infected with streptococcus agalactiae by duplex polymerase chain reaction 2013-08-01 发布 2013-11-01 实施 福建省 质 量技 术 监 督 局 发 布 I DB35/T 1354—2013 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。 本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、顺昌县水产技术推广站。 本标准主要起草人：樊海平、吴斌、张新艳、邓志武、郑磊、钟全福、曾占壮。 1 DB35/T 1354—2013 罗非鱼无乳链球菌病双重 PCR 诊断规程 1 范围 本标准规定了罗非鱼无乳链球菌病的术语和定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、双重PCR 检测和诊断。 本标准适用于罗非鱼无乳链球菌病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改单) 适用于本文件。 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 3 术语和定义 下列术语与定义适用于本文件。 3.1 罗非鱼无乳链球菌病 streptococcosis of tilapia infected by streptococcus agalactiae 罗非鱼受无乳链球菌感染，发生病理变化，出现行为异常或死亡。 4 试剂与溶液 4.1 无乳链球菌 16S rRNA 基因部分序列引物： ——F1：5-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3，浓度10 μmol/L，-20 ℃保存； ——R1：5-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3，浓度10 μmol/L，-20 ℃保存。 4.2 无乳链球菌 sip(表面免疫相关蛋白)基因序列引物： ——F2：5-ATGAAAATGAATAAAAAGGTACTATTG-3，浓度10 μmol/L，-20 ℃保存； ——R2：5-TTATTTGTTAAATGATACGTGAACA-3，浓度10 μmol/L，-20 ℃保存。 4.3 溶菌酶 ( 100 μg/mL) ：生化试剂，-20 ℃保存。 4.4 蛋白酶 K(100 μg/mL)、NaCl ( 3 mol/L) 、裂解缓冲液和 SYBR Green Ⅰ工作液按附录 A 的规定配 制。 4.5 DNA 分子量标准 (0.1 kb~1.5 kb) ：生化试剂，-20 ℃保存。 4.6 阳性对照：无乳链球菌标准株的 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.7 阴性对照：已知无乳链球菌阴性的罗非鱼组织样品 DNA 模板，-20 ℃保存。 4.8 空白对照：无菌双蒸水为空白模板。 2 DB35/T 1354—2013 4.9 除上述试剂与溶液外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 5 章的规定执行，实验室用水符合 SC/T 7014-2006 中第 5 章的规定。 5 仪器与设备 5.1 PCR 扩增仪:配备 25 μL 和 50 μL 的 PCR 反应底座。 5.2 凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。 5.3 电泳仪：输出直流电压 0 V~400 V，直流电流 1 mA~500 mA。 5.4 水平电泳槽：容量 250 mL~650 mL，带凝胶板、样孔梳。 5.5 台式离心机：配置 1.5 mL 转子，转速 16 000 r/min 以上。 5.6 电动组织研磨器：转速 500 r/min~5 000 r/min。 5.7 研磨棒：1.05 Kg/cm2 、121.3 ℃高压蒸气灭菌 15 min。 5.8 离心管：容量 1.5 mL，1.05 Kg/cm2、121.3 ℃高压蒸气灭菌 15 min。 5.9 PCR 反应管：25 μL 和 50 μL，1.05 Kg/cm2、121.3 ℃高压蒸气灭菌 15 min。 5.10 除上述仪器设备外，其余按 SC/T 7202.2-2007 第 6 章的