实验四电泳技术及详解演示文稿.pptVIP

2.4 十二烷基磺酸钠（SDS）的作用 SDS：阴离子表面活性剂，能够使蛋白质的氢键和疏水键 打开，并结合到蛋白质上（结合比为1.4gSDS/1g蛋白质） 使各种蛋白质-SDS复合物都带有相同密度的负电荷，其数 量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同 种类蛋白质间原有的电荷差别。此时蛋白质分子的电泳 迁移率主要取决于其分子量大小。 可以利用SDS测定蛋白质分子量。 实验中同时加入巯基乙醇（强还原剂），使蛋白质分子中的二硫键保持还原状态，利于蛋白质和SDS定量结合。 当前第31页\共有45页\编于星期日\0点 3.转膜实现蛋白从凝胶到膜的转移 常用的固相支持物：NC膜,PVDF膜 转膜方法：电转移法（湿法、半干法） 转膜装置：夹心三明治结构(阴极碳极板、海绵、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵、阳极碳极板)，180mA X 2 hrs/ 100v X 1 hr 转膜效果检测： ①膜的检测：丽春红染膜；应用预染蛋白Marker ②凝胶的检测：考马斯亮蓝染色转膜后的胶 当前第32页\共有45页\编于星期日\0点 4.免疫学检测 封闭：5%脱脂奶粉或BSA，封闭非特异结合位点。 一抗孵育：一抗与封闭液以一定稀释度配比。 二抗孵育：用与一抗种属相同的二抗进行孵育。 检测：利用二抗上的标记物（AP/HRP）可以使底 物显色或发光来