菜豆植物凝集素的理化性质及活性研究.docxVIP

? ? 菜豆植物凝集素的理化性质及活性研究 ? ? 陈 高，朱 洵，曾 芬，何青松，陈禅友 （江汉大学 生命科学学院，湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北 武汉 430056） 凝集素（lectin/hemagglutinin）是一类非酶催化活性、非免疫源性的蛋白质或糖蛋白，能与糖基专一旦多阶地非共价可逆结合，不改变所结合糖基的共价键结构，并具有凝集细胞和沉淀聚糖或糖复合物的作用［1］。菜豆植物凝集素（Phytohaemagglutinin，PHA）含有4个亚基，亚基有两种，E亚基可以凝集红血球，L亚基可以凝集白细胞且具有有丝分裂原活性［2］。 近年来，国内外因食用生的或烹饪不充分的菜豆而引起中毒的事件时有发生［3-4］，但由于菜豆品种繁多，毒性成分各不相同，其中毒原因至今尚无全面阐述。目前，人们普遍认为菜豆凝集素是食用菜豆中毒的主要毒性成分［5］。菜豆凝集素是菜豆植物体内主要的自我防卫机制之一，可以特异性地结合昆虫小肠表面的糖结合位点，阻碍昆虫对营养物质的吸收，并伴随着一系列的并发反应，导致昆虫停止生长及多种病变，严重时导致死亡［6］；菜豆凝集素还可以特异性地与真菌、细菌等微生物表面的各种糖结合蛋白相结合，进而干扰其细胞壁的合成，从而影响到其细胞的正常代谢，对菌类产生抑制作用［7］。因此，菜豆凝集素具有作为一种高效又安全的植物源生物农药的潜质，有潜在的商业应用前景。 目前国内外已经在抗虫、抗菌、抗肿瘤细胞、抗HIV、细胞凝集及促进有丝分裂等多个方面对凝集素展开相关研究［8-9］，并将其广泛运用于抗虫转基因、血型鉴定、亲和层析和靶向药物载体等多个领域［10-11］，但对于菜豆凝集素理化性质的研究还较少。本文探究了菜豆凝集素的理化性质与生物活性，为进一步明晰菜豆中毒原理和解决菜豆不当食用中毒的实际问题提供思路，同时亦可利用其凝集特性与毒性作用开发生产相关产品或制作植物源生物农药。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 菜豆凝集素标准品购自Sigma-aldrich；葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳糖、D-海藻糖、L-鼠李糖、蔗糖、D-麦芽糖、D-果糖、D-木糖、盐酸胍、脲、SDS、氯化钾、氯化钠、醋酸、氢氧化钠、Tris、无水乙醇、碳酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、两水合磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、氯化钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。9种豆科植物材料由湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心提供。 1.2 测定方法 1.2.1 凝集素的血凝活性检验 菜豆凝集素的血凝活性检测采用血凝法［12］。在96孔V型血凝板检的每一孔中加入25μL 0.01 mol/L PBS缓冲液（pH=7.2），然后取25μL样品溶液，加入第一孔，混匀后，取出25μL加至第二孔，混匀后再取25μL，加至第三孔，以此类推，做倍比稀释。同时每孔加入25μL 2%的兔红细胞悬液，并将V型血凝板放在微型振荡器上振荡1 min，25℃下放置2 h，肉眼观察血凝结果。当血红细胞凝成一片时为完全凝集；当血红细胞自然沉降，中间形成小红点时为无凝集；当一半血红细胞凝成一片，一半血红细胞自然沉降，中间小红点为无凝集现象时的一半，此时为半凝集。 凝集素的血凝活性用凝集活力（HU）表示，HU=2n/50μL，其中n为样品在96孔V型板中半凝集时，倍比稀释的孔数。2n为倍比稀释的倍数，即为血凝滴度。 1.2.2 热稳定性的测定 将菜豆凝集素用0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH=7.2）配成初始浓度为1 mg/mL的溶液，在水浴中进行加热处理，按照20、30、40、50、60、70、80、90、100℃依次提高温度，每10℃保持恒温5 min，使用血凝法检测血凝活性。 1.2.3 酸碱稳定性测定 将菜豆凝集素0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH=7.2）配成初始浓度为1 mg/mL的溶液，分别测定其在pH值2～13条件下的血凝活性。其中，pH 2～3，采用0.1 mol/L的KCl-HCl缓冲液；pH 4～5，采用0.1 mol/L的Na Cl-Hac缓冲液；pH 6～7，采用0.1 mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液；pH 8～9，采用0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液；pH 10～11，采用0.1 mol/L的Na HCO3-Na OH缓冲液；pH 12～13，采用0.1 mol/L的KCl-Na OH缓冲液。 1.2.4 金属离子结合特性 将菜豆凝集素用0.01 mol/L的PBS缓冲液（pH=7.2）配成初始浓度为1 mg/mL的溶液，并对0.02 mol/L的EDTA溶液充分透析，再使用3 kD的超滤离心管加入0.2 mol/L的PBS缓冲液（pH=7.2）离心数次，充分去除溶液中的EDTA。向96孔V型凝血板中分