酶分子定向进化.pptVIP

第一页，共三十四页，2022年，8月28日 天然酶的应用及局限性酶的定向进化的思想酶的定向进化的策略和方法酶的定向进化技术的展望  第二页，共三十四页，2022年，8月28日 生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中,并维持其独立性和生命的延续性,都是因为生物体内的一系列酶在发挥着作用.酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得以按照预定的方向有序,精确而顺利地进行,几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关,可以这样说,没有酶的存在,就没有生物体的一切生命活动.  第三页，共三十四页，2022年，8月28日 天然酶的局限性 随着酶催化应用范围的不断扩大和研究的逐步深入,研究者发现,酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求,而且天然酶的稳定性差,活性低使催化效率很低,还缺乏有商业价值的催化功能 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程. 第四页，共三十四页，2022年，8月28日 现代生物工程对酶的要求 能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物进一步增强酶对多种底物的分解能力 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景. 第五页，共三十四页，2022年，8月28日 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶. 第六页，共三十四页，2022年，8月28日 定向进化 定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。 分为分子定向进化和细胞定向进化 第七页，共三十四页，2022年，8月28日 细胞定向进化 细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，目的是改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。 随机突变方法有全基因组重排技术。 基因组重排技术通过把诱变与细胞融合技术相结合，对细胞进行基因组重排，从而大幅度增加细胞的正突变频率。 第八页，共三十四页，2022年，8月28日 分子定向进化 分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技术进行人工突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。 第九页，共三十四页，2022年，8月28日 酶分子定向进化 简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。 第十页，共三十四页，2022年，8月28日 酶定向进化的基本过程 随机突变、构建突变基因文库、定向选择 酶定向进化的基本过程： 酶基因 随机突变 构建突变基因文库 筛选 负突变基因 正突变基因 进化酶 反复进行 第十一页，共三十四页，2022年，8月28日 随机突变的策略易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling):由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术 随机引发重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法 交错延伸技术(StEP):由Zhao 等 提出, 是一种简化的DNA shuffling 技术 基因家族重排技术  第十二页，共三十四页，2022年，8月28日 酶定向进化的特点 1 适应面广 2 目的性强 3 效果显著 第十三页，共三十四页，2022年，8月28日 第二节 酶基因的随机突变 体外随机突变的方法：PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术 基因随机突变方法的特点P207表8－1 随机突变方法可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的定向进化。 第十四页，共三十四页，2022年，8月28日 一 易错PCR技术 在PCR技术的基础上，通过改变反应条件，增加碱基配对错误的出现频率，就成为易错PCR技术。 可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。 第十五页，共三十四页，2022年，8月28日 特点 正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。 第十六页，共三十四页，2022年，8月28日 二 DNA重排技术 概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库