糖尿病视网膜mller细胞的病理改变.docxVIP

糖尿病视网膜mller细胞的病理改变 糖尿病性视网膜病变（iii）是糖尿病的严重并发症。人们普遍认为，针灸主要是视网膜。 微血管病变,但目前许多临床及实验性糖尿病动物模型研究发现:在DR微血管病变发生以前,神经视网膜已有病理改变。本实验通过观察3个月糖尿病鼠视网膜Müller细胞超微结构的变化,GFAP、VEGF表达的改变,以及AGEs对体外纯化培养鼠视网膜Müller细胞活性的影响,旨在研究糖尿病视网膜Müller细胞的病理改变及其机制,初步探讨Müller细胞损伤在DR中的作用,从而更好地了解DR的发病机制。 1 材料和方法 1.1 实验动物 雄性成年SD大鼠20只(复旦大学放射医学研究所动物部),体重(200±20)g,随机分为正常对照组6只,糖尿病组14只。 1.2 实验细胞和培养基 抗兔IgG-FITC二抗、抗鼠IgG-Cy3二抗(华美生物工程公司),链脲菌素(STZ)、小鼠抗大鼠GFAPIgG抗体、兔抗大鼠VEGFIgG抗体(Sigma公司),DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司),JEB-1200EX透射电镜。 1.3 糖尿病大鼠成模试验 糖尿病组14只雄性大鼠腹腔注射STZ(65 mg/kg,0.1 mmol/L柠檬酸钠缓冲液,pH4.0),对照组注射等体积的柠檬酸钠缓冲液,72 h后,血糖大于17 mmol/L为糖尿病鼠,有10只大鼠成模,其中1只糖尿病鼠在饲养期间死亡。3个月后麻醉下处死,摘除眼球,3只糖尿病鼠及1只正常对照组视网膜组织作电镜观察,其余6只糖尿病鼠及5只对照组,左眼球作冰冻切片(10 μm)。 1.4 蛋白质质量浓度检测 AGE-BSA的制备 将质量分数为5%的无球蛋白的牛血清白蛋白与0.5 mol/L D-葡萄糖和1.0 mol/L苯甲基磺酰氟共同溶解于0.2 mol/L磷酸缓冲液中,过滤除菌后置37℃孵箱内孵化90 d。然后在4℃PBS溶液中透析72 h,测定葡萄糖浓度为零,考马斯亮蓝方法定量蛋白质质量浓度,荧光分光光度计鉴定AGE-BSA。AGE-BSA对照物的制备:除不加葡萄糖外,其他材料及方法同上。 1.5 gfapg抗体检测 糖尿病鼠眼球冰冻切片用VEGF IgG抗体、GFAP IgG抗体双标染色,二抗用抗兔IgG-FITC及抗鼠IgG-Cy3,染色程序同常规免疫组织化学染色。激光共聚焦显微镜下观察照相。 1.6 视网膜组织电镜观察 取视网膜组织,2.5%戊二醛、1%锇酸固定,JEB-1200EX透射电镜观察照相。 1.7 视网膜神经元细胞内皮细胞的制备 出生5～7 d SD乳鼠无菌条件下断头处死,钝性分离视网膜,0.125%胰蛋白酶37℃条件下消化20 min,含血清的培养液终止消化,1 000 r/min离心5 min,除去上清液,加入培养液(80%DMEM,20%胎牛血清)吹打使之成为细胞悬液,调整培养液量使细胞密度为3×105/mL,接种于包被鼠尾胶的40 mL培养瓶,于37℃,5%CO2的培养箱内培养。24 h后反复吹打除去漂浮的视网膜神经元细胞及血管内皮细胞。细胞融合后传代,选取2～4代细胞进行鉴定和实验。 1.8 视网膜中的最小细胞免疫组织化学 预先在24孔培养板中置入盖玻片,细胞贴壁融合后PBS冲洗,4%多聚甲醛固定,用ABC法进行GFAP免疫组织化学鉴定。 1.9 最大od值的测定 细胞以4×103/孔接种于96孔培养板,实验组与对照组各4孔,2 h后分别在实验组、对照组加入AGEs及其对照物2 500 μg/mL,培养20 h后加入MTT(1.5 mg/mL,PBS配制)20 μL/孔,4 h后在ELISA仪上测OD值。组间差异的显著性用t检验完成。 2 结果 2.1 女性评估 AGE-BSA溶液作扫描检测,激发光波长峰值为370 nm,发射光波长峰值为440 nm,以此波长,AGE-BSA产生最强荧光。 2.2 vegf阳性染色 正常大鼠视网膜内界膜下、神经节细胞层见GFAP阳性染色,但整个视网膜未见VEGF阳性染色(图1)。糖尿病鼠除视网膜内界膜下、神经节细胞层有GFAP阳性染色外,其余各层也可见丝条状贯穿于内外界膜之间的GFAP阳性染色,并且在上述部位有GFAP和VEGF的共表达(图2～4)。 2.3 视网膜组织电镜观察 与对照组相比,3个月糖尿病鼠视网膜Müller细胞有明显的病理改变(图5,6)。 2.4 视网膜成像中的细胞培养和鉴定 培养的细胞90%表达GFAP(图7)。第2代纯化培养的视网膜müller细胞呈融合状态(图8)。 2.5 体外细胞活性检测 对照组的OD值为0.225±0.009,实验组的OD值为0.262±0.007,细胞活性增加,与对照组相比,差异有显著性意义(P0.01),并且Müller细胞在活性增加的同时