流式细胞术常见实验分析.pptVIP

结果分析 ——Modfit软件分析 第二十七页，共五十二页，2022年，8月28日 图片拷贝：直接Ctrl+C 第二十八页，共五十二页，2022年，8月28日 结果分析 ——Flowjo软件分析 第二十九页，共五十二页，2022年，8月28日 第三十页，共五十二页，2022年，8月28日 第三十一页，共五十二页，2022年，8月28日 2.2.2 S期特异性检测 S期DNA合成期，S期的比例增多往往与细胞分裂的活跃程度相关。传统的PI染色可以通过DNA的倍增区分G1期与G2/M期。S期则因界限不明显，难以区分。若需要准确的统计S期的变化，需要加入S期的特异性标志，即BrdU。BrdU只在DNA合成时被掺入核酸，是指示DNA复制的金标准。因此可通过BrdU-Alex Fluor? 488与PI复染将S期准确的区分开来。 第三十二页，共五十二页，2022年，8月28日 2.2.3 M期特异性检测 G2期是指DNA合成后期，M期是细胞分裂期。二者在细胞周期事件中所处的时项不同，所表示的生物学意义也大不相同。准确检测M期的变化对细胞增殖、凋亡及癌症的研究相当重要。M期的检测标志是丝氨酸磷酸化组蛋白H3(pH3)。当细胞周期从G2期转换到M期时，染色质上的组蛋白H3Ser10发生磷酸化，并在有丝分裂后快速的去磷酸化。由此组蛋白H3的丝氨酸磷酸化变化将停留在G2期的细胞与M期的分裂细胞区分开来。 第三十三页，共五十二页，2022年，8月28日 2.3 胞内活性氧水平的检测与分析 DCFH-DA单染法 DCFH-DA DCFH ROS DCF DCFH-DA进入细胞在细胞内酯酶作用下脱去二脂形成不发荧光的DCFH，当细胞内存在H2O2，O2-，OH-等ROS时被氧化成发绿色荧光的DCF。 第三十四页，共五十二页，2022年，8月28日 注意事项： 第三十五页，共五十二页，2022年，8月28日 （1）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显 结果分析 ——数据分析中几种常见图形及分析原则 分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区； 允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）一般小于1%~5%； 可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。 第三十六页，共五十二页，2022年，8月28日 （2）样本管与阴性对照管峰形重叠 样本管峰形左侧右移，右侧有肩峰，弱阳性的样本常出现此类图形。 分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区应设在两曲线分离处； 可记录阳性细胞百分率（近似值）或平均荧光强度或弱阳性； 允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）高些，但阳性细胞百分率（近似值）应减去假阳性率。 第三十七页，共五十二页，2022年，8月28日 * * * * * 流式细胞术常见实验分析 第一页，共五十二页，2022年，8月28日 1. Guava easycyte 8HT 操作流程2. 四种常见流式细胞术 细胞凋亡的检测与分析 DNA含量检测与细胞周期分析 胞内活性氧水平的检测与分析 细胞表面分子的检测与分析 组合实验 第二页，共五十二页，2022年，8月28日 1. Guava easycyte 8HT 操作流程 ——Incyte模块 1.1 开机-清洗 （原则：先开仪器后开软件，开机必清洗） 1.2 采集样本 1.3 分析 1.4 关机 （原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗） 1.5 日常维护 第三页，共五十二页，2022年，8月28日 1.1 清洗 第四页，共五十二页，2022年，8月28日 1.2 样本采集 edit WL 第五页，共五十二页，2022年，8月28日 第六页，共五十二页，2022年，8月28日 第七页，共五十二页，2022年，8月28日 1.3 分析 见具体实验的分析。 1.4 关机 第八页，共五十二页，2022年，8月28日 1.5 日常维护 保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。 桌面不要有震动，以免光路发生偏移。 上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。 实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，流式专用的物品请不要带走。 做完请记得登记。 每周在周一进行一次easycheck。 （自己在做实验之前也可