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神经组织染色的不稳定因素 神经退行性疾病是由大脑或骨髓的中枢神经或髓鞘炎引起的。随着时间的推移，它会变得聋哑，导致功能性障碍。采用常规染色技术,如HE染色,疾病的某些特殊病理变化难以完全准确的显现,而借助一些特殊染色可对某一特定结构改变进行选择性的浸染。但是,由于后者染色步骤过于复杂,流程相对繁琐,受外界因素的干扰比较大,经常导致染色结果的不稳定,进而难以反映病理改变。目前,系统介绍神经组织染色技术进展的文献甚少,使得神经病理学研究人员,尤其是初学者,难以领会各种染色方法的精髓。根据浸染组织的不同,将神经组织染色分为尼氏染色、神经元染色、神经胶质细胞染色、髓鞘染色、突触染色和神经纤维染色6种。本文就发展成熟的神经组织染色方法原理、优缺点及其病理学应用作一综述,并简述其在神经退行性疾病研究中的应用,旨在指导研究者选用合适的染色方法。 1 尼氏染色及二甲胺四环素 尼氏染色方法是德国病理学家Nissl于1892年创立,其主要根据是神经元胞体内含有大量嗜碱性的尼氏小体。当组织与某些碱性染料(甲粉紫、甲苯胺蓝、硫堇、焦油紫等)作用时,细胞中的尼氏体能够选择性与其结合而着色。Lindroos对尼氏染色方法进行了改良,并应用于颅脑组织切片的病理研究。改良后的方法大大缩短了染色时间,且胞内细胞核,尼氏体均能清晰可见。虽然尼氏染色法既可清晰辨别尼氏体以及胞核、核仁,又很容易区分轴突和树突,但该法仅应用于脑,脊髓等尼氏体较为丰富的组织。尼氏体受染后呈块状(形如虎斑)或颗粒状,核周围尼氏体颗粒较大,近边缘处较小而细长。在神经元受损时,尼氏体的数量可减少甚至消失,因此根据形状大小和数量差异,可判别神经损伤程度。Simon等报道促红细胞生成素对猪缺血/再灌注损伤的治疗作用。经尼氏染色、HE染色和TUNEL免疫组化染色证实,脊髓胸段神经元损伤以及凋亡得到缓解。Pinzon等分别采用动物行为学和尼氏染色评价二甲胺四环素对脊髓挫伤大鼠的神经保护作用。施用二甲胺四环素后,大鼠BBB评分和组织病理学均有改善。缺点是组织未干燥完全,易发生严重皱缩。其次,切片之后易使组织破裂,影响观察。 2 铜银染色及fj染色 神经元染色主要分为镀银染色和FJ染色(Fluoro jade staining)两种方法。镀银染色是由Golgi于1873年建立并成功应用于神经元的特异性染色技术。由于神经元具有较强的嗜银性,当组织处于含有银离子的溶液中,神经元可选择性地浸染银离子。然后通过甲醛溶液可将沉积在组织中的银离子还原为银颗粒,从而使神经元着色。但是,Golgi法只能浸染所有神经元细胞,难以辨别溃变的神经元。Carlsen等发现组织切片经过铜银溶液浸染后,正常神经元被抑制染色,从而区分出溃变神经元,且染色结果背景清晰,溃变神经元及其轴突结构完整。Tenkova等在此基础上对镀银染色进行了改进,使组织切片在4%多聚甲醛溶液中保存时间延长至6个月,仍具较好染色效果,染色结果背景呈金黄色。因而,该方法在神经退行性疾病研究方面被诸多学者所亲睐。Hall等利用铜银染色技术对控制性皮层撞击小鼠进行定量影像分析,同时对神经元退变程度的空间性和时程性作了比较完整的阐述。Macauley等报道了PPT1(一种棕榈蛋白质硫酯酶)缺陷小鼠的小脑病理和运动障碍的结果。经过铜银染色后,发现PPT1缺失后大鼠神经元退变程度明显增加。但由于试剂成本较高,染色步骤较为繁琐,耗时较长,不宜批量制作标本,并且所需器皿均需洁净,否则影响染色结果。此外该染色技术通常采用多聚甲醛溶液及二甲胂酸缓冲液对标本进行灌注固定,且固定时间均需完全,否则神经元不易被浸染或浸染不完全,因此国内报道较少。 FJ染色是近年来新兴的一种神经元染色技术。Fluoro Jade染料对变性神经元具有很高亲和力,在紫外线照射条件下,坏死神经元显现蓝色荧光,由此对损伤神经元进行定性,定量研究。FJ染色不仅可选择性地标记脑及脊髓组织切片上变性神经元的胞体、树突和轴突,而且能显示脑内神经细胞凋亡和组织中淀粉样蛋白沉积。FJ染色除了能浸染溃变神经元外,还可以用于退变有髓纤维束的追踪,如视神经束等。目前用于退变神经元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三种。与FJ和FJB染料相比,FJC染料效果更优,亲和力更高,染色时间短,所需浓度低。此外,其还可与其它荧光素标记物结合进行多重荧光染色。Chidlow等采用FJC和DAPI(一种能够与DNA强力结合的荧光染料)荧光双染技术评价大鼠视网膜和视神经纤维损伤后神经元退变情况。Mechírová等探讨脊髓缺血/再灌注后神经元退变,试验前预先施用去甲肾上腺素和银杏叶乙醇提取物EGb761的家兔,FJB染色结果发现缺血/再灌注后大鼠脊髓侧角Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ对阳性神经元明显下降。 3 神经胶体细胞染色glian 3.1 星形胶