病毒的分离鉴定.docxVIP

病毒的分别与判定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所惹起，则一定知足以下原则： ①从生病者体内分别出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中能够培育； ③证明这类培育物拥有滤过性； ④在原始宿主或有关种属内能产生相同的病症； ⑤能从头分别出病毒。 病毒的分别 1.1标本的办理 1.1.1标本的采集 粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培育基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获取标本，假如液体被污染，应3000×g4℃离心 30min。 组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 1.1.2除菌办理 粪即可加青链霉素使最后浓度为10000单位/毫升，置4℃留宿。 鼻咽拭子一般加抗生素最后浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。 对乙醚有抵挡的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃留宿除菌。 1.2病毒的分别培育 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培育病毒一定使用细胞。依据病毒的不一样采纳敏感人物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分别培育（细胞培育）。 1.2.1鸡胚接种 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天之内的受精卵以保证规格质量上的一致。 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8往后，鸡卵应每日翻动1—2次，以帮助鸡胚发育均匀和防备鸡胚膜粘连。 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育状况（二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的暗影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上即可见到清楚的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有显然的自然转动。③死胎：假如发现鸡卵血管模糊、扩充、胚胎活动呆板或不可以自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完成后，用铅笔画出气室边沿和胚胎的地点待用。 接种： 图1.鸡胚卵黄囊接种：用5～8 天鸡胚，以修长针头由鸡卵气室 端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄 囊膜检查。常用于某些嗜精神病 毒的分别。 图2.鸡胚羊膜腔接种：用12～ 天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的首次分别。 图3.尿囊腔接种用9～12天 鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵 育后取尿囊液检查,常用于培育 流感病毒和腮腺炎病毒等。 图4.绒毛尿囊膜接种：用10～l2天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开—小窗，而后将资料滴在绒毛尿 囊膜上．孵育后。察看膜上有无斑 点病变。常用于培育纯真疱疹病 毒、天花病毒和痘病毒。 剖检及收获 收获前鸡胚应置4℃冰箱留宿，使鸡胚内血液凝结。收获时，用 碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳 膜）。而后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄 囊）再用吸管汲取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保留。 优弊端 长处：技术简单、根源充足、价钱便宜、数目可大、不需特别 设施。弊端：好多病毒不可以适应，主假如哺乳动物的病毒。 1.2.2细胞培育 细胞培育(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分别成单个以致2～4个细胞团悬液进行培育。依据细胞的种类和培育细胞代数的不一样，可将其分为两种：原代细胞培育；传代细胞培育。 组织细胞培育的病毒，当出现稳固的细胞病变后，即可取培育液或培育液与细胞培育物混和物，细胞培育物中的病毒可采纳冻融、超声波等方法使其开释出来。长处： 每个细胞生理特征基本一致，对病毒易感性相等； 无个体差别，正确性和重复性好； 可严格履行无菌操作； 细胞培育自己就能显示病毒的生长特点； 应用空斑技术可进行病毒的克隆化。 病毒的判定 2.1形态学判定 细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE）：病毒在细胞内增殖后，可惹起细胞的不一样变化。常有的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或零落。CPE出现的时间是判定病毒的标记之一。 某些病毒感染细胞产生的特点性的形态变化，在一般光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数目不等的圆形或不规则形的团块状构造，病毒学上称为海涵体。 2.2血吸附和血凝作用 常见于以出芽方式开释的病毒。血吸附指感染细胞拥有吸附红细胞的能力；血凝作用指感染细胞的培育液中有很多游离病毒存在，拥有凝聚红细胞的作用。 2.2.1血吸附实验 拥有血凝能力的病毒能使感染的细胞吸附红细胞，这类现象被称作 吸附作用。大部分黏液病毒能惹起吸附。详细查验步骤以下： 用PBS配制10%的豚鼠红细胞悬液，4℃保留，用前按需要量稀释成0.5%的浓度（10%悬液1ml加19m