第九讲凝胶电泳技术.pptVIP

当前第31页\共有48页\编于星期六\16点 凝胶成像仪 当前第32页\共有48页\编于星期六\16点 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 当前第33页\共有48页\编于星期六\16点 二、琼脂糖凝胶电泳的的影响因素 琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 　　1、 DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 当前第34页\共有48页\编于星期六\16点 （优选）第九讲凝胶电泳技术ppt 当前第1页\共有48页\编于星期六\16点 凝胶电泳(gel electrophoresis)技术 当前第2页\共有48页\编于星期六\16点 核酸分子杂交技术 当前第3页\共有48页\编于星期六\16点 蛋白分子杂交技术 当前第4页\共有48页\编于星期六\16点 细胞转化（原核）/转染（真核） 当前第5页\共有48页\编于星期六\16点 PCR扩增 当前第6页\共有48页\编于星期六\16点 DNA测序 DNA测序仪 当前第7页\共有48页\编于星期六\16点 蛋白测序 当前第8页\共有48页\编于星期六\16点 文库构建 当前第9页\共有48页\编于星期六\16点 酵母双杂交 当前第10页\共有48页\编于星期六\16点 RNA干扰(RNAi):转录后基因沉默技术 当前第11页\共有48页\编于星期六\16点 第一节 凝胶电泳技术 凝胶电泳（Gel electrophoresis） 是以凝胶为载体，以电流为驱动，用于分离不同大小、形状、等电点等分子的技术。凝胶电泳通常用于分析用途。但也可以作为制备技术，如在使用质谱(MS)、PCR、克隆、DNA测序、免疫印迹等检测之前用于提纯分子。 当前第12页\共有48页\编于星期六\16点 一、核酸的凝胶电泳 基本原理 在buffer为PH8.0时，带有负电荷的 DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定介质（琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 当前第13页\共有48页\编于星期六\16点 电泳槽 电泳仪 梳子 电泳槽 制胶板 正极电源插孔 负极电 源插孔 电源线 电泳槽 当前第14页\共有48页\编于星期六\16点 当前第15页\共有48页\编于星期六\16点 当前第16页\共有48页\编于星期六\16点 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型 ①分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移率要快； ②同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比线性DNA分子要快，线性DNA分子比开环DNA分子要快。 当前第17页\共有48页\编于星期六\16点 图2 线性DNA电泳图 当前第18页\共有48页\编于星期六\16点 凝胶电泳的分辨力： 与凝胶的类型和密度相关 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间; 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间 当前第19页\共有48页\编于星期六\16点 聚丙烯酰胺凝胶电泳图（高分辨率，1bp差异可区分） 琼脂糖凝胶电泳图 当前第20页\共有48页\编于星期六\16点 （一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。 分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。 当前第21页\共有48页\编于星期六\16点 LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min 应用：直接酶切，回收DNA分子； 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液。 当前第22页\共有48页\编于星期六\16点 琼脂糖凝胶电泳图 当前第23页\共有48页\编于星期六\16点 琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE或TBE 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压