高中：农杆菌转化法.docxVIP

利用农杆菌转化法将北极海鱼的抗冻基因导入到番茄细胞，获得具有抗冻性状的番茄, 具体操作如下： ,获得目的基因：可用 或者（PCR）扩增得到目的基 因，前提是;若抗冻基因序列未知，可构建包含抗冻基因 在内的,然后从中获取。 .（核心）:将抗冻基因和Ti质粒通过 形成重组质粒，能形成重组质粒的原因是： （答出2点）。实际操作中，常采 用双酶切法，目的是：o影 响拼接效率的因素除了温度、pH、渗透压等环境因素以及反应时间外，还有： （答出2点）。 .将重组DNA分子导入农杆菌：用 处理农杆菌，目的是增大农杆菌细胞膜的 通透性，使其处于一种 的状态，这种细胞称为 o影响转化的因素除了温度、pH、渗透压等环境因素以及转化时 间外，还有： （答出2点）。转化 之后，加入液体培养基，置于 上慢速振荡培养一段时间，目的是 o选用的农杆菌应该是 限制性核酸内切酶缺陷型，原因是。 .筛选含有目的基因的农杆菌：由于,因此需要进 行筛选。可以利用Ti质粒上的标记基因进行筛选,也可以采用 鉴定目的基因是否导入成功。 .转化：将成功导入目的基因的农杆菌和植物组织共培养，在共培养过程中实现 o影响转化效率的因素有农杆菌的数量、共培 养的时间和温度等环境条件，还有（答 出2点）。共培养后，将植物材料转入含 的培养基中 培养，同时添加 以去除附着的农杆菌。 .检测植物细胞是否成功导入目的基因：可采用。 .植物组织培养转基因番茄：成功导入目的基因的番茄外植体经脱分化形成愈伤组织， 利用愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是通过调节营养物质和植物生长调节剂 的适当配比，诱导出芽和根的，进而再生出新植株的 途径；二是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的 途径。 第二条途径中，也可以先将含有愈伤组织培养物的试管放在摇床上，通过 分散成单细胞。这种单细胞经过培养基中成分的诱导，可发生类似 受精卵经过卵裂、分化、而发育成胚的过程，即从单细胞依次到细 胞团、和胚状体，最后再生出完整的植株。 .目的基因的表达：可通过 技术、技术在分子水 平上检测目的基因是否表达，也可在个体水平检测，具体操作是： 利用农杆菌转化法将北极海鱼的抗冻基因导入到番茄细胞，获得具有抗冻性状的番茄, 具体操作如下： .获得目的基因：可用化学合成法或者聚合酶链式反应（PCR）扩增得到目的基因，前 提是目的基因（抗冻基因）序列已知；若抗冻基因序列未知，可构建包含抗冻基因在 内的基因文库，然后从中获取。 .形成重组DNA分子（核心）：将抗冻基因和Ti质粒通过限制性核酸内切酶和DNA 连接酶形成重组质粒，能形成重组质粒的原因是：有互补/相同的粘性末端，均为双螺 旋结构。实际操作中，常采用双酶切法，目的是：防止目的基因自身环化，防止目的 基因和质粒反向拼接。影响拼接效率的因素除了温度、pH、渗透压等环境因素以及反 应时间外，还有：目的基因的浓度、Ti质粒的浓度、DNA连接酶的浓度和活性。（插 入到Ti质粒的T-DNA区段） .将重组DNA分子导入农杆菌：用氯化钙处理农杆菌，目的是增大农杆菌细胞膜的通 透性，使其处于一种能吸收周围环境的DNA分子的状态，这种细胞称为感受态细胞。 影响转化的因素除了温度、pH、渗透压等环境因素以及转化时间外，还有：重组DNA 分子的浓度，农杆菌的种类、数量，农杆菌的状态。转化之后，加入液体培养基，置 于摇床上慢速振荡培养一段时间，目的是使CaCL处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态 （表达抗生素抗性基因）。选用的农杆菌应该是限制性核酸内切酶缺陷型，原因是防止 限制性核酸内切酶将目的基因剪切。 .筛选含有目的基因的农杆菌：由于并不是所有的农杆菌都接纳了重组DNA分子，因 此需要进行筛选。可以利用Ti质粒上的标记基因进行筛选，也可以采用PCR或者核酸 分子杂交技术鉴定目的基因是否导入成功。 .转化：将成功导入目的基因的农杆菌和植物组织共培养，在共培养过程中实现T-DNA 转移并整合到植物细胞的染色体上。影响转化效率的因素有农杆菌的数量、共培养的 时间和温度等环境条件，还有农杆菌的种类，番茄的种类，番茄的基因型，外植体发 育阶段，外植体的取材部位。共培养后，将植物材料转入含植物生长调节剂和营养物 质的培养基中培养，同时添加抗生素以去除附着的农杆菌。 .检测植物细胞是否成功导入目的基因：可采用PCR或核酸分子杂交技术。 .植物组织培养转基因番茄：成功导入目的基因的番茄外植体经脱分化形成愈伤组织, 利用愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是通过调节营养物质和植物生长调节剂 的适当配比，诱导出芽和根的顶端分生组织，进而再生出新植株的器官发生途径；二 是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。第二条途径中, 也可以先将含有愈伤组织培养物的试管放在摇床上，通过液