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l137在口腔扁平苔藓病损中的表达及意义 抗菌剂是自然界中广泛存在的一种具有抗菌和肿瘤活性的生物源性茶多酚。存在于人类黏膜组织的抗菌肽主要包括防御素家族和Cathelicidins家族。LL37是人类唯一的Cathelicidins家族成员, 其两端均为亮氨酸残基 (leu) 、含有37 个氨基酸的成熟肽, 主要表达于上皮细胞和中性粒细胞。研究表明LL37在皮肤黏膜免疫中具有重要作用。口腔扁平苔藓 (oral lichen planus, OLP) 是口腔黏膜常见的慢性炎症性疾病, 目前病因不确切。本研究旨在探讨LL37在OLP患者病损中的表达水平及规律, 分析LL37在OLP发病机制中的作用。 1 材料和方法 1.1 临床资料及免疫组化检测 选择经本院活检确诊的25 例OLP初诊患者口腔黏膜病损组织, 其中男10 例, 女15 例, 年龄19～72 岁, 平均年龄47.2 岁, 病程2 周～8 年。所有患者均无全身系统性疾病, 无其它确诊口腔疾患, 所有病例均由2 位口腔病理医师确诊。7 例正常口腔黏膜组织纳入对照组。切取新鲜病变组织5 mm×5 mm大小2 份, 一份液氮速冻后储存于-70 ℃冰箱以备采用RT- PCR法检测LL- 37 mRNA表达水平;另一份4%中性甲醛固定, 常规石蜡包埋, 4 μm厚连续切片行病理诊断及免疫组化染色检测LL- 37表达。所有纳入研究对象均获知情同意。 1.2 pcr检测细胞内引物 鼠抗人LL- 37单克隆抗体 (美国 Santa Cruz公司) , UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒 (福州迈新生物技术开发公司) , 组织/细胞 (小量) RNA抽提试剂盒 (上海华舜生物工程有限公司) , 逆转录试剂盒、100 bp ladder DNA Marker (美国MBI公司) , 目的基因和内参引物 (上海生物工程技术服务公司) , Taq酶、dNTP、buffer、Mg2+(宝生物工程大连有限公司) 。 1.3 细胞培养及鉴定 主要步骤如下:石蜡切片脱蜡、水化后, 微波抗原修复, 过氧化酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性, 正常非免疫动物血清孵育, 滴加LL37第一抗体 (工作浓度为1∶150) , 4 ℃过夜, 滴加生物标记的第二抗体, 计滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液, DAB溶液显色, 显微镜下观察3～10 min, 苏木精复染, 梯度酒精脱水干燥, 二甲苯透明, 中性树胶封固。对照设置:PBS代替一抗作为空白对照, 用已知阳性切片作阳性对照。结果判断:参照阳性对照切片, 将在胞质中出现棕黄色颗粒的细胞判定为阳性细胞。结果判断综合考虑阳性细胞的着色强度及着色细胞百分比2 个因素 (表 1) 。对染色阳性切片选择5 个不相重叠的高倍视野 (×400) , 将上皮层分不全角化层、颗粒层、棘层、基底层, 淋巴细胞分别计数, 观察阳性细胞着色强度以及着色细胞百分比。 1.4 pcr扩增 具体步骤如下: 取OLP患者口腔病损组织50 mg加1 ml裂解液, 总RNA提取严格按照试剂盒说明书操作。用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果并摄影。同时采用UV分光光度计测定A260/A280值。RNA-70 ℃保存备用。 根据测得的RNA浓度, 取4 μl RNA严格按照试剂盒说明书进行逆转录。得到的cDNA -20 ℃保存或直接进行PCR扩增反应。 PCR反应总体积为20 μl。LL37上游引物为5′- GAA GAC CCA AAG GAA TGG CC- 3′, 下游引物为5′- TCA GAG CCC AGA AGC CTG AG- 3′, 扩增条件为95 ℃预变性2 min后, 按94 ℃变性20 s, 57 ℃退火40 s, 72 ℃延伸40 s, 共循环31 次, 最后在72 ℃延伸8 min。预期扩增产物片断为547 bp。β- action内参上游引物为5′- ATT GCC GAC AGG ATG CAG AA- 3′, 下游引物为5′- GCT GAT CCA CAT CTG CTG GA- 3′, 扩增条件与LL- 37相同。预期扩增产物片断为150 bp。取目的基因和内参产物各5 μl混合用2%琼脂糖凝胶100 V稳压电泳1 h, EB染色。紫外灯下观察结果并摄影。 采用图像分析系统扫描仪测定每组标本扩增产物的吸光度值 (A) , 分别计算出LL- 37与β- action灰度的相对比值代表LL- 37mRNA的水平。 1.5 设计背景方差齐或参数检验中的秩和检验 采用SPSS 12.0统计软件分析。计量资料采用成组设计两样本比较的t检验 (方差齐) 或非参数检验中的成组设计两样本比较的秩和检验 (方差不齐) ;计数资料采用非参数等级资料检验中的