荧光原位杂交FISH试剂盒.docxVIP

PAGE 1 PAGE 1 / 5 Version1.1 荧光原位杂交（FISH）试剂盒说明书 荧光原位杂交（FISH）试剂盒说明书 一、 检测原理 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization)，简称为 FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是：用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补配对原则，与待检测的染色体或 DNA 纤维切片上的靶 DNA 特异结合，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体。随后在荧光显微镜下对待测DNA 进行定性、定量或相对定位分析。 二、 组分和保存条件 成分 二甲苯 容量（50 tests） 10ml 储存 室温 20×SSC 10ml 室温 蛋白酶 K 20ul -20℃ 杂交缓冲液 8ml 室温 去离子甲酰胺 14ml 室温 DEPC 水 5ml -20℃ DAPI 25ul -20℃ 目的基因探针 2OD -20℃ 阳性对照探针 2OD -20℃ 阴性对照探针 2OD -20℃ 注意： 20×SSC 用一级纯水稀释成 2×SSC 使用。 二甲苯、去离子甲酰胺在通风橱使用。 蛋白酶 K 用 2×SSC 按照 1:1000 稀释。 探针应避光稀释并保存，且实验过程中加入探针后的操作应在避光条件下进行。 DAPI 用 PBS 按照 1:1000 稀释，需避光保存和使用。 三、 实验方法 脱蜡： 石蜡切片在 60oC 烤箱中预热 30 min； 每张切片滴加二甲苯 100ul 中 60oC 放置 20min； 在梯度酒精中（100%、95%、90%、80%）室温孵育各 10min。 蛋白酶处理： 蛋白酶K 溶液预热至 37oC； 每张切片滴加蛋白酶K 溶液 100ul，37oC 孵育 20min； 每张切片滴加 2×SSC 溶液 100ul 在室温下洗切片 3 次，每次 1min； 梯度酒精 70%、80%、90%、100%（-20 oC 预冷）脱水，每次 2min，空气中干燥。 变性： 1）78 oC 预热变性液； 每张切片滴加预热变性液 100ul，78 oC 孵育 8 min； 梯度酒精 70%、80%、90%、100%（-20 oC 预冷）脱水，每次 2min，空气中干燥。 杂交： 准备探针，1OD 探针用 40ulDEPC 水溶解，避光备用； 配制杂交溶液，例：70ul 杂交缓冲液，2ul 探针，28ulDEPC 水，终体积为 100ul；（可先做预实验确定所需的探针浓度，即探针5 ul -0.6 ul ，杂交缓冲液 70ul，加 DEPC 水补足至100ul。设置浓度为 50 ug/ml ，20 ug/ml，12.5 ug/ml， 6 ug/ml 四个梯度。3）准备湿盒，交叉放置切片； 滴 100ul 杂交溶液在切片上，加盖玻片； 盖上湿盒盖，37 oC 孵育 12-16h。 杂交后水洗： 1）43 oC 预热杂交后水洗溶液； 2）镊子小心去除切片上的盖玻片，每张切片滴加预热的杂交后水洗溶液100ul 洗切片 15min； 3）2×SSC（37 oC）洗 2 次，每次 10min； 4）PBS 洗 1 次，10min。 细胞核染色： 每张切片加 10ulDAPI，覆盖盖玻片并在室温下避光孵育 5min； 显微镜下观察，或置于湿盒中 4 oC 保存。 四、 实验案例 4.1 200× 白光视野 红光视野（CY3 标记探针杂交） 4.2 400× 蓝光视野（DAPI 染核） MERGE 白光视野 红光视野（CY3 标记探针杂交） 蓝光视野（DAPI 染核） MERGE