实验十 血清转氨酶的活性测定.docVIP

血清转氨酶的活性测定 实验目的 了解分光光度计的使用方法 了解血清ALT测定方法的原理 实验原理 1、转氨基作用 指的是一种氨基酸alpha-氨基转移到一种alpha-酮酸上的过程。转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨基酸的氨基与alpha-酮酸的酮基进行了交换。 结果是生成了一种非必需氨基酸和一种新的alpha-酮酸。反应由转氨酶和其辅酶磷酸吡哆醛催化。磷酸吡哆醛是维生素B6的衍生物。人体内最重要的转氨酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶。它们是肝炎诊断和预后的指标之一。 2、转氨酶活力的测定 ALT作用于丙氨酸及α－酮戊二酸基质，反应生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可以与2，4 －二硝基苯肼定量反应生成丙酮酸苯腙，在碱性条件下呈红色，可以用分光光度法定量检测（500nm)。 三、实验器材、试剂 1、仪器 723型分光光度计 2、试剂 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4），ALT底物液（含丙氨酸（过量）， α－酮戊二酸）、 2，4 －二硝基苯肼溶液，0.4mol/LNaOH溶液，2umol/L丙酮酸标准液。 四、实验步骤 1、标准曲线的绘制 按下表操作 试剂/mL 对照 1 2 3 4 丙酸酮标准液 0 0.15 0.3 0.45 0.6 ALT底物 0.6 0.45 0.3 0.15 0 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 置37℃水浴5min，各管加2，4-二硝基甲苯溶液1ml，混匀，再在37℃水浴放置20min，各管加0.4mol/L氢氧化钠2ml，混匀，10min后，以对照组调零测A500.以各管吸光度为横坐标，以相应的ALT单位为纵坐标绘制标准曲线。 血清ALT的测定 按下表操作 试剂/ml 测定 对照 血清 0.1 0.1 ALT底物液 0.6 --- 置于37℃ 2，4-二硝基甲苯 1 1 ALT底物液 --- 0.6 置37℃ 五、实验数据级结果 1、数据记录 丙酮酸标准液/ml 0 0.15 0.3 0.45 0.6 血清ALT ALT活力单位/dl 0 10．56 21.12 31.68 42.24 A500 0 0.157 0.268 0.414 0.484 0.025 标准曲线如下图 2、按照标准曲线查出样品的酶活力单位数为1.97U. 思考题 血清ALT活力测定时，对照管也加入了相应体积的血清，为什么这样做？ 答: 血清中即使不加入ALT底物，其中也有成份可以与2，4－二硝基苯肼作用，生成物在碱性条件下呈红棕色。对照组加入血清正是为了消除这部分误差。