第九章聚合酶链反应及相关技术.ppt

同一对引物同时扩增靶基因和内标准品，双通道荧光检测系统可以特异地同时检测出内标准品和靶基因的扩增产物，计算出靶基因起始拷贝数 内参照系统避免了由于不同抽提效率导致的样本间的差异，使结果的重复性更好，定量更为准确,但仍不能监控内标准品和靶基因是否有一致的扩增效率 二、定量PCR 第六十一页，共八十六页，2022年，8月28日 三、多重PCR(multiplex PCR) 在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份 DNA样本中多个靶片段 第六十二页，共八十六页，2022年，8月28日 四、PCR诱导定点突变 1.引入点突变 A B A B P2 P1 PCR 用酶A和B消化，将突变位点引入PCR产物 第六十三页，共八十六页，2022年，8月28日 2.引入大片段缺失 四、PCR诱导定点突变 第六十四页，共八十六页，2022年，8月28日 一个分子的模板经过30个循环，理论上即可得230(约109)个拷贝产物 实际反应中，每个循环的扩增效率大多约为85%左右 三、PCR的反应条件 第二十九页，共八十六页，2022年，8月28日 扩增反应的平台效应： PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25～35个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。 三、PCR的反应条件 第三十页，共八十六页，2022年，8月28日 指数增长期 线形增长期 平台期 循环数 理论值 实际值 Log 产物DNA 4.PCR实时监测 三、PCR的反应条件 第三十一页，共八十六页，2022年，8月28日 平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生 反应体系各组分的消耗 引物和已扩增的DNA片段间的竞争等 三、PCR的反应条件 第三十二页，共八十六页，2022年，8月28日 四、PCR技术的质量控制 1.实验室的规范化设置 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 第三十三页，共八十六页，2022年，8月28日 2.防污染体系： 正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施 反应体系中以dUTP取代dTTP，加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），破坏以往的扩增产物 每次实验完毕后须用1g/L次氯酸钠清洁实验台面，或用254nm波长的紫外光近距离充分照射 四、PCR技术的质量控制 第三十四页，共八十六页，2022年，8月28日 3.PCR技术的质量保证 基因扩增检验的全过程的质量保证 分析前 分析中 分析后 室内质量控制和室间质量评价 四、PCR技术的质量控制 第三十五页，共八十六页，2022年，8月28日 第二节 以PCR为基础的相关技术 第三十六页，共八十六页，2022年，8月28日 第二节 以PCR为基础的相关技术 一、逆转录PCR 二、定量PCR 三、多重PCR 四、PCR诱导定点突变 五、连接酶链式反应 六、随机扩增多态性DNA 第三十七页，共八十六页，2022年，8月28日 一、逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等 第三十八页，共八十六页，2022年，8月28日 逆转录合成cDNA所用的引物： 以PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物 以oligo(dT)作为引物 以人工合成的随机序列（六核苷酸混合物）作为引物 一、逆转录PCR（RT-PCR） 第三十九页，共八十六页，2022年，8月28日 一、逆转录PCR 第四十页，共八十六页，2022年，8月28日 二、定量PCR(quantitative PCR) 对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析 主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等 第四十一页，共八十六页，2022年，8月28日 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR(real-time PCR) FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中的产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量 二、定量PCR 第四十二页，共八十六页，2022年，8月28日 荧光信号的检测方法 二、定量PCR 1.DNA结合染料技术 2.水解探针技术 3.杂交探针技术 4.分子信标技术 第四十三页，共八十六页，2022年，8月28日 1.DNA结合染料技术 PCR反应体系中加入SYBR Green I染料，能选择性地掺入至双链DNA分子中，并且产生强烈荧光 PCR过程中，SYBR Green I染料结合到新合成的双链DN