MTT实验操作步骤.docxVIP

MTT 的操作方法 一、MTT 是什么 MTT 是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetra zoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名： 噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 二、MTT 法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。 MTT 主 要 有 两 个 用 途 1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定； 2．细胞增殖及细胞活性测定。 三、为何MTT 可以用来做上述工作 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD 值），来判断活细胞数量，OD 值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 四、实验所需材料 MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的终浓度为 5mg/ml,须用PBS 或生理盐水做溶剂。市面上一般MTT 的包装为 100mg,250mg 或 1g 对于 100mg 这样的小包装，厂家都是将MTT 放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg 用 20mlPBS 来溶解。 具休做法：预 先在 50ml 离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入 20ml PBS，从中先吸取 500-1000u l PBS 装入含MTT 的小管中，吹打若干次后将其移入50ml 离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的 MTT 不残留于管内。将 MTT 完全混匀后，用 0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20 度。按细胞培养板每孔需加 10ul 计算，一般每 96 孔板约需 1ml，所以分装时可考虑每管分装 1ml。 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP 管里，用的时候现配，直接往培养板中加。 注意事项： l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 l 配成的MTT 需要无菌，MTT 对菌很敏感 lMTT 一般最好现用现配，过滤后 4 度避光保存两周内（个人曾做过4 度避光保存 4 周的M TT 溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融， 最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用。 lMTT 有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. MTT 甲瓒溶解液 二甲基亚砜 DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。 三联溶解液：SDS10g，异丁醇 5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成 100ml 溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT 方法，中国医药工业杂志，1993，24 （10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。（个人觉得其溶解的能力不如DMSO 强） 该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至 室温，将SDS 结晶全部溶解后再使用。 五、MTT 法实验步骤 1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至 5-10×1 04/ml。 细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。 对于初学者而言，要使细胞达到 5-10×104/ml 往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。 以一般细胞培养常用的 25cm2 为例， 细胞密度在长到约 80%~90%（下图所示为 80%~90%密度时细胞的大致状态），消化离心收集后，将上清去掉，加入 3ml 培养基使其混匀。 另取一支新的 15ml 无菌离心管（为下一步接种 96 孔板用），装入约 9ml 培养基. 从第一步准备的 3ml 细胞悬液中取 1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于 5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板 4 个大格内每大格平均 5-10 个细胞（见下图）；如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul 计算。 )细胞数量因实验