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单克隆抗体的几个问题 一 杂交瘤细胞的第二次筛选要进行抗体检测阳性！ 1 骨髓瘤细胞同效应 B 细胞融合后产生的细胞不一定可以分泌抗 体，即该基因不一定会表达出来，所以要筛选出可以分泌抗体的杂交 瘤细胞. 2 杂交细胞有多种（被免疫生物 B 淋巴细胞又百万种） 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选 ，第一次筛选出杂交瘤 细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原 理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培 养是第一次筛选的关键。普遍采用的 HAT 选择性培养液是在普通的动 物细胞培养液中加入次黄嘌呤（ H ）、氨基喋呤（A ）和胸腺嘧啶核苷 酸（T ）。 其依据是细胞中的 DNA 合成有两条途径：一条途径是生物合成途 径（“D 途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为 DNA 分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参 与这一过程，而 HAT 培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻 断 DNA 合成的“D 途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S 途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 （HGPRT ）和 胸腺嘧啶核苷激酶 （TK ）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核 苷酸，两种酶缺一不可。因此 ，在HAT 培养液中，未融合的效应 B 细 胞和两个效应 B 细胞融合的“D 途径”被氨基喋呤阻断 ，虽 “S途径” 正常 ，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力 ，一般 10d 左右会死亡。 对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言 ，由于通常采用的骨髓瘤 细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型 （HGPRT ）细胞，因 此自身没有“S 途径”，且 “D途径”又被氨基喋呤阻断 ，所以在HAT 培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应 B 细胞相互 融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应 B 细胞的“S 途径”，又具有骨 髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在 HAT培养液中选 择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法： 通常采用有限稀释克隆细胞的方法， 将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一 个或几个杂交瘤细胞（理论上 30%的孔中细胞数为 0 时，才能保证有 些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定 特异抗体的杂交细胞株。 如何进行抗体检测来筛选杂交瘤细胞 分别提出杂交瘤细胞产生的抗体,看能否和抗原形成杂交带 二 浆细胞（或者免疫的 B 淋巴细胞）与骨髓瘤细胞的融合 三 腹水怎么来的！ 多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。 单克隆恶性浆细胞(即骨髓瘤细胞)的大量增殖,侵犯骨髓与骨质，产生 溶骨性改变；并影响骨髓的造血功能，导致贫血与出血。同时还产生 大量单克隆免疫球蛋白 ，影响正常免疫球蛋白的生成，增加患者对细 菌与病毒的易感性，由于免疫球蛋白或其多肽链亚单位 （轻链 ）由尿 中排出，常导致肾功能损害。 由于血浆中蛋白质含量的降低 ，引起水分大量进入到组织液中形 成了腹水 ． 四 、杂交瘤的克隆化和冻存 克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过 HAT 筛选后的杂 交瘤克隆不能保证一个孔 内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有 数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所 需要的抗体特异性抗体分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这 些细胞彼此分开 ，就需要克隆化。 克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆 化 ，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制 ，因为抗体非 分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快 ，二者竞争的结果 会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的 再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失 ，从而丧失产生抗体 的能力。