第二章基因操作的工具酶详解演示文稿.pptVIP

1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略 第二节 DNA连接酶及其应用 当前第31页\共有63页\编于星期五\9点 DNA连接反应的条件 连接反应最佳温度为37℃，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15℃连接。 影响连接效率的因素有： A. 温度（最主要的因素） B. ATP的浓度( 10?M - 1?M ) C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） D. 反应时间（通常连接过夜） E. 插入片段和载体片段 的摩尔比 转化 4℃ 过夜 加反应液 CK- 重组菌落 CK+ 当前第32页\共有63页\编于星期五\9点 1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略 第二节 DNA连接酶及其应用 当前第33页\共有63页\编于星期五\9点 粘性末端DNA片段的连接 Nick Nick 当前第34页\共有63页\编于星期五\9点 平末端DNA片段的末端加尾连接法 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 末端核苷酸转移酶 +dATP +dTTP 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ AAAAA TTTT DNA聚合酶和 T4DNA连接酶 当前第35页\共有63页\编于星