DNA提取实验报告.docx

大肠杆菌和植物基因组 DNA 提取生科基 彭健鹏 2012141242048 大肠杆菌 DNA 提取方案设计 实验目的 学习并掌握细菌基因组的提取方法 提取大肠杆菌 DH5α中的 DNA 并进行质量检测实验概述 提取 DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀使 DNA 从溶液中析出。 试验准备 实验材料：大肠杆菌 DH5α 菌液 实验试剂：LB 液体培养基，TE 溶液，10%SDS，蛋白酶 K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇 实验仪器与用具：微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf 管，恒温摇床 实验步骤 将 2mL 培养至对数期的大肠杆菌 DH5α菌液 5000rpm 冷冻离心 10 分钟弃上清； 目的：分离大肠杆菌与其培养液。 加 190μL TE 悬浮沉淀，并加 10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL 蛋白酶K，混匀，37℃保温 1h； 目的：裂解大肠杆菌。 加 30μL 5mol/L NaCl，混匀； 目的：盐析。NaCl 降低 DNA 在水中的溶解度且不破坏其结构,从而提取粗的DNA。在浓氯化钠（1-2M）溶液中， DNP 的溶解度很大， RNP 的溶解度很小； 在稀氯化钠（0.14M）溶液中， DNP 的溶解度很小， RNP 的溶解度很大； 0.14MNaCl-0.01MEDTA 溶解 RNP，而使 DNP 沉淀。 加 30μL CTAB/NaCl 溶液，混匀，65℃保温 20min； 目的：CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀。通过离心就可将 CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀 DNA，而 CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。 （5）加入 300μL 酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm 离心 10min， 将上清液移至干净离心管； 目的：分离蛋白多糖和 DNA，得到较纯的 DNA，若此步得到 DNA 不纯，可重复此步骤进行多次纯化。 加300μL 异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；5000rpm 离心 10min，沉淀DNA，加入 500μL70%乙醇，5000rpm 离心 10min，弃乙醇，吸干； 目的：将 DNA 沉淀出，进一步用乙醇促进 DNA 析出水。 取少量用光谱仪测 DNA 质量，并取少量跑电泳。目的：对 DNA 纯度的检测。 注意事项 DNA 浓度和纯度的测定方法 从提取的 DNA 样品中取出 1μL，用 TE 稀释到 100μL，用紫外/可见分光光度计，分别测定 260 nm 和 280 nm 的吸光值 OD260 和 OD280，计算检测 DNA 的纯度、浓度和产率。 (1)DNA 纯度＝OD260/OD280 DNA 的纯制品的 OD260/OD280 值为 1.8，而 RNA 的纯制品的 OD260/OD280 值为 2.0。若 OD260/OD280 值高于 1.8，那么说样品中可能有 RNA 的污染；若样品中蛋白或酚的污染较严重则 OD260/OD280 值低于 1.8。 (2)DNA 浓度（ng/μL）＝OD260×50μg/mL×100 倍（1 OD260=50ng/μl） (3)DNA 产率（ng/g·FW）＝OD260×50μg/mL×100 倍×50μL/0.5 g （体 积/取材量） 植物基因组 DNA 提取 实验目的： 了解真核生物基因组 DNA 提取的一般原理； 掌握植物基因组 DNA 提取的方法和步骤。 实验原理： 使用液氮对植物叶片进行研磨，在保证破碎细胞的同时，会大大降低酶活，减少 DNase 对植物基因组 DNA 的降解作用。 植物提取液中含有 SDS 可溶解蛋白，使之变性从而脱离基因组 DNA。 提取液中 EDTA 同样可通过螯合金属离子从而使 DNase 丧失活性，保护植物基因组 DNA 不被降解。 实验材料： 液氮。 细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl pH8.0，5mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl， 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇。 5mol/L KAC 饱和酚 氯仿/异戊醇（24：1） 异丙醇 70%乙醇 ddH O 2 实验步骤： 取 500μL 细胞提取液于 65℃水浴中加热。 研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干净），去除主体叶脉，剪成细条状，置