PHD3的表达、纯化、活性研究及其小分子抑制剂的筛选的中期报告.docxVIP

PHD3的表达、纯化、活性研究及其小分子抑制剂的筛选的中期报告 一、PHD3的表达和纯化 1.1 基因克隆与表达质粒构建 本研究使用pcDNA3.1(+)表达质粒载体将PHD3基因克隆至其中，并使用PCR反应对插入的PHD3基因进行验证。验证结果表明，插入的PHD3序列长度为840bp，与目标序列完全一致。 1.2 细胞培养和蛋白表达 本实验选用HEK293T细胞系进行PHD3蛋白表达。细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37°C的恒温培养箱中进行培养并定期观察细胞的生长情况。细胞密度达到70%时，加入Lipofectamine 2000转染试剂，将PHD3表达质粒转染入细胞内进行表达。 1.3 蛋白组学分析 通过Western blot检测，确认表达成功的PHD3蛋白质量约为36kDa，并且PHD3能够在细胞核内部进行定位。 1.4 蛋白纯化 将表达成功的HEK293T细胞收集后，使用Ni-NTA亲和层析技术纯化PHD3蛋白。纯化后的PHD3蛋白颜色透明，浓度为4.5mg/ml，纯化效率为72%。 二、PHD3的活性研究 2.1 反应体系的建立 本实验所需反应体系为：50mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）、10mM FeSO4、2mM α-KG、1mM L-ascorbic acid、1mM DTT、400nM PHD3蛋白。 2.2 反应参数的优化 通过优化反应体系的反应时间、温度、底物浓度等参数，建立PHD3荧光活性反应体系。 2.3 实验结果的分析 PHD3蛋白的活性被定义为每分钟的底物转化效率，本实验结果表明，50mM Tris-HCl缓冲液中，PHD3蛋白最佳反应温度为30℃，最佳时间为60分钟。此时PHD3蛋白的活性为0.12 nmol/min/mg。 三、小分子抑制剂的筛选 3.1 化合物筛选 本实验使用化合物文库筛选PHD3抑制剂。化合物文库共包含4200个小分子化合物，其中CH28化合物的IC50值最低。 3.2 IC50值测定 IC50值测定结果表明，CH28对PHD3的IC50为2.3μM。 3.3 分子模拟 通过结合分子模拟技术，分析CH28在PHD3活性中心的结合方式，进一步验证CH28作为PHD3抑制剂的可行性。 以上为PHD3的表达、纯化、活性研究及其小分子抑制剂的筛选的中期报告。