第二章沉淀法课件.pptxVIP

;什么是沉淀法？ 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？ 常用的沉淀方法包括哪些？ 何谓盐析？其原理是什么？ 常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？ 等电点沉淀的原理是什么？;1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。 2、沉淀法的目的： ?通过沉淀达到浓缩的目的； ?沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化 ； ?将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。;? 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 ? 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的 溶解度不同而达到分离的目的。 ? 溶剂组分的改变、改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。;沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：;① 首先加入沉淀剂; ② 沉淀剂的沉化，促进粒子生长； ③ 离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。;沉淀法不仅可以用于实验室中； 也可广泛用于生产的制备过程。 因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生 物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。;优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、 选择性不强。;根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： 盐析法； 等电点沉淀法； 有机溶剂沉淀法； 亲和沉淀法； 选择性沉淀法。 复合盐沉淀法； 非???子型聚合物沉淀法； 聚电解质沉淀法；;二、蛋白质的溶解特性;蛋白质的溶解行为;防止蛋白质凝聚沉淀的屏障;;1、定义;2、盐析法机理;3、盐析过程;盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济;在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。;盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 （1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来； （3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好； （4） 不易引起蛋白质变性。;6、盐析操作(加盐方式）;一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分 盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。;㏒ S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度;有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度， 则上式成为 （用浓度代替离子强度）;8、用盐析法分离蛋白质的二种方法;由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀 时所需的离子强度也不相同。 改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白 质分批盐析分开。;分段盐析的条件先需要进行小实验探索。 先进行0%-30%的硫酸铵沉淀，再进行30%-60%的硫酸铵沉淀，最后进行60%-80%的硫酸铵沉淀。;9、盐析用盐量的确定---饱和度;调整硫酸铵溶液饱和度计算表;10、盐析的影响因素 1）pH值;pH值;在进行盐折时，必须控制pH 图中直线都相互平行 Ks β;2）温度的影响;3）蛋白质浓度;对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。;11、盐析注意事项;盐析注意事项;12、盐析法特点;四、等电点沉淀法;1、定义和原理;大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况;2、等电点沉淀法注意事项;;概念：在含有溶质的水溶液中加入一定 量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作 用，是较早使用的沉淀方法之一。;2、有机溶剂沉淀法机理;3、常用的有机溶剂;1、温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在???温下进行 有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，增加有机溶剂对蛋