westernblot详细图解分析和总结.docxVIP

Western 免疫印迹（Western Blot） 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。 经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜） 上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检 测蛋白水平的表达。 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 蛋白质样品 丙烯酰胺 SDS Tris-HCl β-巯基乙醇ddH2O 甘 氨 酸 Tris 甲 醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰 乙酸 脱脂奶粉 硫酸镍胺 H2O2 DAB 试剂盒 电泳仪 电泳槽 离心机 离心管 硝酸纤维素膜 匀浆器 剪刀 移液枪 刮棒 一、试剂准备 SDS试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 匀浆缓冲液： M Tris-HCl(pH ml； 10%SDS ml；β-巯基乙醇 ml；ddH O ml。 2 转膜缓冲液：甘氨酸 g；Tris g；SDS g；甲醇 200 ml；加 ddH O 定容至 1000 ml。 2 M PBS：NaCl g；KCl g；Na HPO g； 2 4 KH PO g；加 ddH O 至 1000 ml。 2 4 2 膜染色液：考马斯亮兰 g；甲醇 80 ml； 乙酸 2 ml；ddH O118 ml。包被液（5%脱脂奶 2 粉，现配）：脱脂奶粉 g 溶于 20 ml 的 M PBS 中。 显色液：DAB mg； M PBS ml；硫酸 镍胺 ml；H 0 μl。 2 2 二、蛋白样品制备 单层贴壁细胞总蛋白的提取 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 每瓶细胞加 3 ml 4℃预冷的PBS（ ～）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 按 1ml 裂 解 液 加 10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 每瓶细胞加 400 μl 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞 碎片和裂解液移至 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 于 4℃下 12000 rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷） 将离心后的上清分装转移倒 ml 的离心管中放于－20℃保存。 组织中总蛋白的提取 将少量组织块置于 1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 加 400 μL 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 ml 离心管中，然后在 4℃下 12000 rpm 离心 5 min，取上清分装于 ml 离心管中并置于－20℃保存。 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按 1 操作外还应收集培养液中的细胞。 以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 将培养液倒至 15 ml 离心管中，于 2500 rpm 离心 5 min。 弃上清，加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后 2500 rpm 离心 5 min。弃上清后用 PBS 重复洗涤一次。 用枪洗干上清后，加 100 μL 裂解液（ 含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm 离心 5 min，取上清分装于 ml 离心管中并置于－20℃保存。 三、 蛋白含量的测定 制作标准曲线 从－20℃取出 1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。 取 18 个 ml 离心管，3 个一组，分别标记为 0 mg， mg， mg， mg， mg， mg。 按下表在各管中加入各种试剂。 混匀后，室温放置 2 min。在生物分 光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色