WB实验步骤分析和总结.docxVIP

实验材料： 蛋白电泳（制胶、SDS电泳） SDS凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDSLoading Buffer（还原，5×）、G250 蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml 离心管、5ml 移液器、微量移液器、1.5ml 离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： 配制 10%APS 溶液：-20 度保存 0.5g APS + 5ml 蒸馏水、2.5g APS + 25ml 蒸馏水 配制 200 ml 电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 配制 1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul 蒸馏水实验步骤： 一．制胶： 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 SDS分离胶的浓度与最佳分离范围 SDS SDS分离胶浓度 6%胶 8%胶 10%胶 12%胶 15%胶 最佳分离范围 50-150kD 30-90kD 20-80kD 12-60kD 10-40kD 配制 10%分离胶： 将不同体积的 30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。加入 10%APS 和 TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS分离胶 所需各组分体积（单位： 所需各组分体积（单位：ml） 分离胶 凝胶 浓度 体积 30%Acr- 双蒸水 Bis(29:1) 分离胶缓冲液 （4×） 10%APS TEMED 精选文档 精选文档 PAGE 3 PAGE 3 — 5ml 2.08 1.67 1.25 0.05 0.002 10ml 4.17 3.33 2.5 0.1 0.004 15ml 6.25 5.0 3.75 0.15 0.006 20ml 8.3 6.7 5 0.2 0.008 10%待胶灌至距离玻璃板顶端 1.5cm 的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40 分钟至 1 小时。 10% 待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 配制 5%浓缩胶： 所需各组分体积（单位：ml）凝胶 所需各组分体积（单位：ml） 凝胶 30%Acr-Bis( 浓缩胶缓冲液 10%AP TEME 体积 双蒸水 29:1) （4×） S D 2ml 1.14 0.34 0.5 0.02 0.002 4ml 2.28 0.68 1 0.04 0.004 6ml 3.42 1.02 1.5 0.06 0.006 8ml 4.56 1.36 2.0 0.08 0.008 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20 分钟，等待浓缩胶聚合。 待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二． SDS电泳: 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 制备样品： 1） 蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液 蛋白提取液 + 5×上样缓冲液 + 蒸馏水，上样量为 40-60ug。 制备的样品，煮沸 5 分钟，12,000 rpm 离心 5 分钟，取上清，上样。 泳道样品 泳道 样品 1 Marker 2 样品 1 体积 10μl 20μl 3 4 5 6 7 8 9 10 样 品 样 品 样 品 样 品 样 品 样 品 样 品 样品 2 3 4 5 6 7 8 9 20μl 20μl 20μl 20μl 20μl 20μl 20μl 10μl 电泳：浓缩胶 80V，约 20 分钟，分离胶 100V，约 1 小时。 一、考马斯亮蓝染色 注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行 western blot 检测。 将电泳后的PAGE 胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE 胶为宜），加热至沸腾后 5 分钟，弃去蒸馏水； 加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后 5 分钟，弃染色液； 加入适量蒸馏水，加热至沸腾后 5 分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。 观察拍照。 Western Blot 溶液配制： 配制 500 ml 1×TBST 溶液： 50 ml TBST（ph8.3,10×）+ 450 ml 蒸馏水 配制 100 ml 5%牛奶封闭液：4 度保存 5 克脱脂奶粉+ 100 ml 1×TBST 配制 100 ml 转膜缓冲液（甲醇）：CW0044