1氧-植物二烯酸还原酶OPR酶联免疫分析ELISA.docxVIP

12-氧-植物二烯酸复原酶（OPR）酶联免疫剖析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定有关样本中12-氧-植 物二烯酸复原酶（OPR）含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中12-氧-植物二烯酸复原酶（OPR）水平。用纯化 的12-氧-植物二烯酸复原酶（OPR）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中 挨次加入12-氧-植物二烯酸复原酶（OPR）抗原，再与HRP标志的12-氧-植物二烯酸复原 酶（OPR）抗体联合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过完全清洗后加底物 TMB显色。 TMB在HRP酶的催化下转变成蓝色， 并在酸的作用下转变成最后的黄色。 颜色的深浅和样 品中的12-氧-植物二烯酸复原酶（OPR）呈正有关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度 （OD值），经过标准曲线计算样品中 12-氧-植物二烯酸复原酶（ OPR）浓度。 试剂盒构成： 试剂盒构成 48孔配置 96孔配置 保留 说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保留 标准品：225ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保留 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保留 酶标试剂 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保留 样品稀释液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保留 显色剂A液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保留 显色剂B液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保留 停止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保留 浓缩清洗液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保留 标本要求： 1．标本收集后尽早进行提取，提取按有关文件进行，提取后应赶快进行实验。若不可以 立刻进行试验，可将标本放于-20℃保留，但应防止频频冻融 2．不可以检测含NaN3的样品，因NaN3克制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，而后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；而后从第一孔、第二 1 孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔， 再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50μl， 混匀；而后在第三孔和第四孔中先各取 50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔 中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各 取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50μl，混 匀后从第七、第八孔中分别取 50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准 品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取 50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为 50μl， 浓度分别为150ng/L，100ng/L ，50ng/L，25ng/L，12.5ng/L）。 2. 加样：分别设空白孔（空白比较孔不加样品及酶标试剂，其他各步操作同样） 、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 40μl，而后再加待测样品 10μl（样 品最后稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不涉及孔壁，轻轻晃动混 匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。 4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩清洗液用蒸馏水 30（48T 的20倍）倍稀释后备用。 5. 清洗：当心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满清洗液，静置 30 秒后弃去，这样 重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 清洗：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 停止：每孔加停止液50μl，停止反响（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序丈量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加停止 液后15分钟之内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中拿出应在室温均衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保留。 2．浓清洗液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，清洗时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并常常校正其正确性，以防止试验偏差。一次加样时间最好 控制在5分钟内，如标本数目多，介绍使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值 大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释必定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以防止交错污染。 6．底物请避光保留。 7．严格依据说明书的操作