植物生物技术5_实验三：植物原生质体的分离、纯化与检测-华中农业大学课件.pdf

实验四 植物原生质体的分离、纯化与培养 一实验目的 ●了解植物原生质体分离和纯化的原理 ●掌握植物原生质体分离、纯化和培养的方法 ●掌握原生质体活力测定和原生质体计数的方法 二实验原理 ●植物原生质体是指细胞中去掉了细胞壁后的部分 ●植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作用下，细胞壁 被消化 ●纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶是用来降 解连接细胞的中胶层，使细胞丛组织中解离出来，可以得到裸 露的原生质体 ●原生质体在合适的培养条件下，能再生细胞壁，进行分裂、生 长、形成愈伤组织 ●进一步分化成根和芽，长成新的植株，表现了植物细胞的全能 性 ●培养的原生质体在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好， 所以要进行原生质体计数 三材料与用品 1、材料：棉花胚性愈伤组织，拟南芥叶片 2、器材和用具：低速离心机，血球计数板，不锈 钢筛(140和400目),普通显微镜，玻璃试管 及吸头 台盼蓝 四实验步骤 1、材料的准备 (1)拟南芥无菌苗的制备(第2周已种) (2)胚性愈伤组织诱导和继代(研究生完成) 2、原生质体酶解分离 (1)愈伤组织原生质体的分离：1g颗粒状、新鲜的愈伤组织于6cm培 养皿中，加入6ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇 床，40转酶解14小时 (2)叶肉原生质体的分离：取约2g拟南芥幼嫩叶片于6cm培养皿中， 用解剖刀将叶片切碎，加入6ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口， 28℃黑暗条件下酶解4小时 3、原生质体的纯化 渣加入CPW9M洗涤，滤液在10ml的玻璃离心管中离心4～5分钟 (800rpm),使原生质体沉于管底，细胞壁等碎片浮在液面 ②弃除上清夜，原生质体加入2ml的CPW9M轻轻混匀 一条带，其它的杂质及少量的原生质体沉于管底 ④将原生质体轻轻地吸出，转入另一试管，加入5ml CPW9M溶液洗涤， 离心4～5min(800rpm) 上清液，加入1ml CPW9M溶液悬浮 4、原生质体活性检测 伊红Y检测法 ①吸取少许原生质体悬液涂于载玻片上，滴一滴伊红Y, 染色5分钟，轻轻加上盖玻片 ②在光学显微镜下观察，调整不同光源，取5任意视野分 别总原生质体数和有活力的原生质体数。活力用暗视野 下未染上色的原生质体数占同一明视野原生质体数的比 例表示 5、原生质体计数 ①将血球计数板及盖片用水 擦试干净 ②用滴管吸取少许原生质体 悬液，从计数板中间平台 两侧的沟槽内沿盖玻片的 下边缘摘入一小滴 ③低倍镜下找到计数室后， 再转换高倍镜观察并计数 求出每一个小格中原生质 体平均数(N),按公式计 算出每ml(g)悬液所含原 生质体数量 五注意事项 ·原生质体纯化时，两种洗液的使用顺序和用量的比例不 要颠倒了 。原生质体纯化时，吸取原生质体带动作要轻，尽量一次 吸完 ·使用血球计数板时首先要清楚使用的是哪种计数板 ·吸取悬液的量尽量少，避免悬液的高度过高，加盖片时 要轻，以免原生质体密度不均一 六实验结果 A