苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒orf129基因敲除实验的中期报告.docxVIP

苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒orf129基因敲除实验的中期报告 本实验旨在通过敲除苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Alfalfa mosaic virus, AMV）orf129基因，探究该基因在AMV感染过程中的作用及其对寄主植物的影响。本文是该实验的中期报告，主要介绍实验设计、方法和进展。 实验设计 本实验选取AMV-Cg和苜蓿（Medicago sativa）为实验对象，通过CRISPR/Cas9技术敲除AMV的orf129基因，构建AMV的orf129基因缺失体系。比较AMV-Cg和AMV-Cg?orf129在苜蓿上的生长和病毒繁殖能力，并研究orf129基因的敲除对AMV感染苜蓿的影响。 方法 1.设计sgRNA：根据AMV-Cg段的序列，选择了orf129基因内部作为目标位点，设计了两个sgRNA，通过连接大肠杆菌质粒pRGEB32中的Cas9 nuclease融合蛋白，形成CRISPR-Cas9质粒。经过测序确定sgRNA的准确性并进行扩增和电泳检验。 2.转化大肠杆菌DH5α：将CRISPR-Cas9质粒转化至大肠杆菌DH5α中，筛选经过鉴定的正式菌株进行后期的质粒提取、纯化和测序。 3.烟草悬浮细胞转化：从AMV-Cg中提取RNA后，构建cDNA文库，并进行限制酶切，将ORF129基因序列下游添加构建clone，得到orf129缺失的AMV-Cg。将Control和orf129缺失的AMV-Cg构建为植物半微型载体，并转化进烟草悬浮细胞。 4.苜蓿转化：将编码AMV-Cg和orf129缺失的AMV-Cg的载体转化至Agrobacterium tumefaciens中，进行菌液感染和接种，获得转化植株。 进展 在本实验中，我们已经完成了CRISPR/Cas9质粒的构建以及大肠杆菌DH5α的转化工作，并通过对CRISPR/Cas9质粒和大肠杆菌的培养和鉴定，确保了菌株和质粒的质量。同时，我们也已经从AMV-Cg中提取RNA并构建了cDNA文库，得到了orf129基因缺失的AMV-Cg，并通过电泳检测确定DNA片段长度和纯度。下一步的工作是将Control和orf129缺失的AMV-Cg构建为植物半微型载体，并进行烟草悬浮细胞与苜蓿的转化，为后期的实验打下基础。 结论 本实验旨在探究AMV的orf129基因在植物中的作用及其对植物的影响，通过CRISPR/Cas9技术敲除AMV的orf129基因，构建AMV的orf129基因缺失体系。在实验进行的过程中，我们已经完成了CRISPR/Cas9质粒的构建、大肠杆菌DH5α的转化、RNA的提取和文库构建等工作，并获得了orf129基因缺失的AMV-Cg。我们将进一步完成植物转化和进一步实验，探究orf129基因在AMV感染过程中的作用及其对寄主植物的影响。