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实验一 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳 【实验目的】 了解电泳的一般原理，掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术。 测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。 【实验原理】 带电荷的胶体粒子在电场中移动的现象称电泳。醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持物。 血清中含多种蛋白质，当在pH 这 8.6 时，这些蛋白质均带负电，它们在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质所带负电荷多少及颗粒大小不同，所以在同一电场，同一 pH 环境中涌动速度不同。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白，α~球蛋 白，β~球蛋白，γ~球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分，立体构象，分子量，等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小，等电点低，相同碱性pH。 表 1 人血清中 12 种蛋白质的等电点及分子量 蛋白质名称 等电点（pl） 分子量 清蛋白 4.88 69000 α~球蛋白 5.06 α1—200000 β~球蛋白 5.12 α2—300000 90000—150000 γ~球蛋白 6.85-7.50 156000—30000 缓冲体系中，带负电喝多的蛋白质颗粒在电场中移动速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清中pH=8.6 的缓冲体系中电泳 1h 左右，染色后可显示5 条区带。清 蛋白泳动最快，其余依次为α1~，α2~,β~及γ~球蛋白。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单，快速。 图 1 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 为清蛋白，2，3，4，5 分别为α1,α2,β~及γ~球蛋白，6 为点样原点 清蛋白 球蛋白 附注 妊娠 ↓↓ α1 α2 β ↑ γ ↓ 中毒时更明显，产后 2-3 个月正常 婴儿 ↑ ↑ ↑ 6 个月时γ正常，其他成分 6-10 岁时正常 糖尿病 ↓ 多发性骨髓瘤 ↑ ↑ ↑↑ 异常球蛋白，可在β和γ区带间出现M 区带 肝硬变 ↓↓ ↑ ↑ ↑↑ 在晚期失代偿时 阻塞性黄疸 ↑ 无丙种球蛋白血症 ↓↓ 全身性红斑狼疮 ↓ ↑↑ ↑ 类风湿性关节炎 ↓ ↑ 风湿热 ↑ ↑ 淀粉样变性 ↓↓ ↑↑ 肾病 ↓ ↑↑ ↑ ↓ 优点。目前，已成为临床生化检验的常规操作之一。 【临床意义】 清蛋白 62-72% α1—球蛋白 3-4% α2—球蛋白 6-10% β~—球蛋白 7-11% γ~—球 蛋白 9-18% 血清蛋白电泳的病理改变多半是清蛋白降低和一种或二种以上球蛋白增加。表 2 血清蛋白的临床意义 【试剂】 巴比妥缓冲液（pH=8.6 离子强度为 0.06）：称取巴比妥纳 12.76 克，巴比妥 1.66 克，置于盛有 200ml 蒸馏水的烧杯中稍加热溶解后，移置100ml 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。 染色液：氨基酸 B0.5 克，加甲醇 50ml,冰乙酸 10ml，蒸馏水 40ml，溶后备用。 漂洗液：甲醇或乙醇 45ml，加冰乙酸 5ml，蒸馏水 50ml 混匀即可。 洗脱液：0.4mlNaOH 透明液：冰乙酸 25ml，加 95%乙醇 75ml 混匀。 【操作】 1. 准备点样：将薄膜条（8×2cm）侵入巴比妥缓冲液，再于薄膜的无光泽面的一端 1.5cm 处，用毛细管或玻片取血清呈直线状滴加，等渗入膜内后，将薄膜有样品的一面向下（以防蒸发干）贴在电泳槽架上，两端用浸湿的滤纸作桥贴紧。盖严，平衡5 分钟。 2. 通电：一般电压为 120-140V，电流约（0.4-0.6mA/cm）通电 45-60 分钟，待电泳区带展开约 25-35mm 后关闭电源。 染色：通电完毕，将薄膜直接浸于染色液中，2-3 分钟后取出，用漂洗液清洗数次，脱色至背景为无色。 定量：将漂洗净的薄膜吸干，剪下各个蛋白质带，同时按各区带的平均宽度剪下一条空白区带，然后分别浸入 0.4MNaOH5ml 的试管中，振摇数次，使色泽浸出。于620 毫微米波长处比色，以空白带浸出液调整零点，测各部分光密度为：A，α1，α2，β，γ， 按下列方法计算： 光密度总和T＝A+α1+α2+β+γ 各部分蛋白百分含量为： 清蛋白（%）＝A/T×100% α1 球蛋白（%）＝α1/T×100% α2 球蛋白（%）＝α2/T×100% β球蛋白（%）＝β/T×100% γ球蛋白（%）＝γ/T×100% 透明：待薄膜完全干燥后，浸入透明液约 5-10 分钟，取出平贴在玻璃板上，完全干燥后即成透明的膜，可于光密度计上测定密度，或作标本永远保存。 结果分析 【作业与思考】 根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在 pH＝8.6 的巴比妥缓冲液中移动的相对位置？ 实验二 ALT 测定标准曲