基因工程第三章Junfinalversion.pptxVIP

第三章 基因工程载体Cloning Vectors第三章??基因克隆载体 第一节?? 质粒载体 第二节?? 噬菌体载体 第三节???真核细胞的克隆载体第二节噬菌体载体一、噬菌体的一般生物学特性二、λ噬菌体载体三、粘性质粒四、单链DNA噬菌体载体一、噬菌体的一般生物学特性 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。噬菌体的结构烈性噬菌体温和噬菌体溶源化细菌溶源化原噬菌体噬菌体的侵染与包装二、λ噬菌体载体λ噬菌体的电子显微镜照片（一） λ DNA分子1.λ基因组DNA的特点 a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需DNA序列． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’ b) λ基因组DNA上有56种限制酶识别位点．2. λ基因组DNA的结构λ噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A～ J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和NCI基因， O-R 为裂解区.λ噬菌体的基因组图及EcoRI酶切图环化后的λ基因组DNAA：成熟包被，切开cos环，D,E：(占头蛋白75%)W,F：头尾连接Int(整合),Xis(删除),Red促重组N(早期调控)促O,P(复制).Red,Xis,Int转录和整合。Q(晚期调控)促头,尾,S,R基因表达和溶菌CI,CII,CIII为负调控，阻止溶菌人为将λ噬菌体基因组分为3个区域：左侧区：自基因A到基因J，包含外壳蛋白的全部编码基因。中间区：介于基因J和基因N之间，这个区又称为非必需区，与噬菌斑形成无关，被外源DNA片断取代后，并不影响噬菌体的生命活动。中间区包含重组基因和整合切割基因。右侧区：位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因及复制基因和裂解基因。3. λDNA的复制裂解周期早期：环状的λDNA分子按θ型双向复制，复制起点位于O基因内，需要O、P基因编码蛋白的参与。晚期：控制滚环型复制的开关被启动，复制从θ型转变为滚环型复制，合成出一系列λDNA线性排列的多聚体分子。cos位点是λ噬菌体正确包装的必需位点。λ噬菌体DNA的复制溶原性周期λDNA复制以另外一种形式进行，稳定的整合到宿主染色体上并随之一起复制。cI基因表达，合成参与溶菌周期活动的所有基因被阻遏的蛋白质。附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现。原噬菌体的删除作用整合作用需要int基因的表达，是一种可逆的过程：一方面，噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNA上，成为原噬菌体；另一方面，在适当条件下，原噬菌体又可以脱离宿主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。 λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和int基因的协同作用才能实现。4. λ噬菌体的组装（二） λ噬菌体载体的构建1. 野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆位点。包装限制: λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的75-105%，即39-52.5 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有与λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入22 Kb。2. λ噬菌体的改造切除非必需区段（重组基因簇）:1/3 非必需区段切除必需的的RE识别位点，在非必需区引入合适的RE识别位点引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选 建立重组λDNA分子的体外包装系统，通过无意义突变将其改造成安全载体，以利于生物学防护。2. λ噬菌体的改造1) 除去多余的限制酶识别位点天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。 通过自然选择法筛选无EcoRI识别位点的λ-噬菌体 2. λ噬菌体的改造2) 切除掉λDNA的非必需区载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离