实时定量PCR完全手册.docxVIP

方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 RT-qPCR是由三个步骤组成1、反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA2、扩增:用PCR的方法扩增cDNA3、检测:实时检测和定量扩增的产物RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Keyporint)1、分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2、反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3、数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。 QRT-PCR抑制物的组成QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应，高度的抑制还导致假阴性的结果。 抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG. 存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流