微生物实验报告_5.docVIP

酸奶的巴氏消毒和菌种的鉴定 1.1前言： 酸乳生产后的热处理既可以杀灭酵母菌、霉菌等污染物，又有助于延长产品的保质期，是改善酸乳的保存性的技术方法之一。经过无数次的科学验证，确立了最早的巴氏消毒法为低温长时间加热法，其次是高温短时间杀菌法，最新的为“延长保存期奶”法。乳酸菌近年来广泛运用于食品，保健品和某些疾病的辅助治疗，对人体健康具有重要意义，鉴于它来源的广泛性，种的多样性和食用人群的敏感性等，对其进行正确的鉴定分离是保证食品安全的重要基础，除培养基鉴定法外，目前最快最全面的方法为多重PCR法。 2.2方法 2.2.1巴氏消毒法灭菌及细菌的培养 生理盐水的制备 ⑴准确称取3.5gNacl置于小烧杯中，加少量蒸馏水，用玻棒搅拌，让其充分溶解。 ⑵用玻棒引流入500ml容量瓶中，3~4次加入约20ml的水用以冲洗小烧杯和玻棒，并将冲洗的水全部引流入容量瓶中。 ⑶继续向瓶中加入蒸馏水至离刻度线2~3cm处时，改用胶头滴管滴加至液面凹液面与刻度线在同一水平线上。 ⑷盖紧瓶塞，上下颠倒摇匀5~6次，将容量瓶中配好的生理盐水转入三角烧瓶中，用胶塞塞紧三角瓶瓶塞。 玻璃器皿及生理盐水的灭菌 ⑴ 先用胶塞塞住每个试管的试管口（注意：选用大小合适的橡胶塞，即塞好后，胶塞在试管外的距离约为2cm，），再用牛皮纸包住试管上部，6支试管为一组，共三组，留两支试管备用。将试管等玻璃器皿及生理盐水放入高压锅中灭菌。（注意：不能动安全阀，放气不能太快） 培养基的制备 ⑵准确称量现成的MRS培养基干粉 g，倒入灭菌大烧杯中，向其中加入500ml蒸馏水。将大烧杯置于电炉上，边加热边用玻棒混匀，至液体沸腾，停止加热。 酸奶的巴氏消毒及稀释 准确称量40g酸奶，倒入灭菌锥形瓶中，准确量取160ml灭菌生理盐水，与酸奶混匀。（以下所说酸奶均为此被1∶5稀释过的酸奶） 将未灭菌.经63℃消毒30min.80℃消毒15min和90℃消毒5min后的酸奶均如下图所示倍比稀释。 细菌的培养 ⑴ 在无菌平皿边缘，贴上写有各个稀释度和消毒温度（未灭菌的，即表“未”）的酸奶。 ⑵用1ml灭菌移液管从最大稀释度开始，从上一实验已稀释的酸奶样品中，分别吸取1ml的10﹣1.10﹣2.10﹣3和10﹣4 稀释度的四种奶加到平皿中。 ⑶各平板倾注约15ml已融化并冷却至45℃左右的MRS培养基，放置在桌面上，轻轻旋动，让其混匀，然后放置至培养基凝固。 ⑷将所有的平板倒置入密封罐内，准确称取10g水.1g焦油没食子酸.0.1gNaOH依次置于皿盖中，用玻棒快速混匀后置于密封罐中，盖紧罐盖。 ⑸放在42℃培养箱内，培养48h。观察培养基中菌落的形态，并对比消毒前后及三种消毒法中所长菌落的数量。以相同的稀释倍数为一组，选出不含霉菌的组，再选择长有30~300个菌落的平板计数。 2.2.2初步染色鉴定乳酸菌 ⑴涂片 用经火焰灭菌的接种环在玻片中央勾1~2环水，再用接种环于培养基上挑取适量菌落，将沾有菌落的接种环置于载玻片上的蒸馏水中涂抹，使菌悬液在在载玻片上形成均匀的薄膜。 ⑵固定 让其自然风干，涂菌面朝上，通过火焰2~3次。 ⑶初染 滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1~2min后倾去染液，水洗至流出无色。（注意：冲洗时不要冲着涂菌部位，也不要使染液沾染到手） ⑷煤染 先用革兰氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1~2min,倾去碘液，水洗至流出无色。 ⑸脱色 用滴管流加95%乙醇脱色，至流出液无色时立即用水洗去乙醇。 ⑹复染 用沙黄复染1~2min，水洗，吸去残水，晾干。（注意：不要用纱布或纸直接擦拭涂菌部位） ⑺镜检 油镜检查。 2.2.3乳酸菌的初步鉴定 ⑴试管的高压灭菌，方法与相同。 ⑵用注射器向每支试管内均加入5ml新鲜的消毒奶。 ⑶用灭菌接种环于培养基上挑取适量菌落，在每支试管牛奶中混匀。 ⑷塞紧试管塞，将试管置于试管架上，放于37℃培养箱中培养24h。 ⑸观察牛奶是否凝固，闻一闻是否有异味。 2.2.4乳酸菌的再次染色鉴定 用灭菌接种环沾取少量牛奶，用如2.2.2的方法染色，鉴定。 3.实验结果 3.1巴氏消毒 温度 浓度 10-2 10-4 63℃ 156个 120个 80℃ 80个 38个 90℃ 102个 45个 通过实验我们得到了在85℃条件下消毒的细菌效果最显著且通过巴氏消毒细菌明显减少许多，巴氏消毒可以杀灭一部分细菌。 3.2细菌的培养 通过倾注法培养后，未经过巴氏消毒的牛奶培养后在培养基上长出小而多的细菌菌落，而已经巴氏消毒的牛奶培养后在培养基上长出的菌落较未巴氏的