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生物化学（上）实验 实验一、氨基酸的纸层析 一、实验目的：1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析的原理和操作技术； 2、掌握影响分配系数的因素。3、学会分析未知样品的氨基酸成分。 二、原理 滤纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。有机相流经固定相支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示： Rf ＝原点到层析斑点中心的距离 / 原点到溶剂前沿的距离 物质结构、溶剂系统的物质组成等因素都会影响Rf值。 三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸（5）小型玻璃喷雾器（6）铅笔、直尺等。3、试剂：（1）氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、组氨酸标准品。（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0.25%的水合茚三酮溶液。 四、实验步骤：1、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg混合溶于10%异丙醇中。2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。3、点样：用毛细管点样，中间的点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。4、展层：向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm，约50－60ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。5、显色：用喷雾器将0.25％茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。 五、实验结果与计算： 1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf值。3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。 六、注意事项 1. 为了防止滤纸被手上的汗液污染，应尽量在操作时带手套。 2. 重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。 七、思考题 1、如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？ 2、纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？ 实验二、蛋白质的性质 实验目的 1、加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知识 2、掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分析的方法及原理 一、蛋白质呈色反应 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生成有色物质的反应。 （一）双缩脲反应 1、实验原理 双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一个颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酪基(即肽键：-CO-NH-)的化合物与碱性铜溶液作用，形成紫色或蓝紫色复合物，利用这个反应借助分光光度计可以测定蛋白质的含量。 双缩脲试剂有NaOH和CuSO4配制而成，必须当场配制当场使用。 2、试剂 蛋白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，通过2-3层纱布滤去不溶物） 0.1%的甘氨酸溶液 0.01%精氨酸溶液 10%NaOH溶液 1%CuSO4溶液 3、实验操作观察现象 取试管4支，按照下表加入各种试剂，观察现象 试剂 管号 1 2 3 4 蛋白质样（ml） 1.0 0.01%精氨酸（ml） 1.0 0.1%甘氨酸（ml） 1.0 10%NaOH（ml） 2.0 2.0 2.0 2.0 蒸馏水（ml） 1.0 1%硫酸铜溶液(滴) 4.0 4.0 4.0 4.0 现象 （二）茚三酮反应 1、实验原理 在弱酸条件下（pH5-7），蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋白质和α—氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物),含有氨基的其他化合物亦可发生此反应。 2、试剂 蛋白质样液（与双缩脲反应相同） 0.1%的甘氨酸溶液 0.2%茚三酮溶液 3、实验方法 取试管2支，分别加入蛋白质样液及0．1％甘氨酸溶液1ml，然后各加入茚三酮溶液0.5ml，混匀后于沸水浴中加热数分钟，观察现象。 二、蛋白质沉淀反应 蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。 （一）蛋白质的盐析作用 1、实验原理 盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋