蛋白质酶抗体标记课件.pptxVIP

第十一章 标 记;标记的概念 指以共价键的方式将放射性元素（如3H、 14C、32P、35S、125I）或非放射性物质（如地高 辛、生物素、酶、荧光素）结合到某些生命物质（如DNA、RNA、寡核苷酸、抗体、抗原及某些小分子物质）上的过程 标记技术已在序列测定、分子杂交、免疫分析等领域得到广泛应用；主要用于生命物质的定性、定量 由示踪物和被标记物构成的复合物称为探针或某物的标记物;第一节 核 酸 标 记;核酸标记是指能与特定核酸序列（靶序列）发生特异性互补（杂交），并含示踪物的已知核酸片段（DNA或 RNA）;一、标记物的制备及类型;(二)核酸标记类型 ?(同位素)核素标记 通常采用的同位素有32P、33P、35S，其中 32P活性强，信号比较好 放射性探针与固相载体上的靶核酸杂交后，洗涤除去未杂交的探针，再通过X-射线衍射和放射自显影检测分析结果（但此法须在特殊实验室进行，???止同位素伤人） ?非同位素标记 以生物素、地高辛和荧光素等非核素为示踪物，采用发光法或生色法检测（此法灵敏度与核素标记相仿，但无核素污染问题，已成为标记技术的发展趋势）;二、非核素标记;（一）地高辛（DIG）;随机引物介导法是将线性DNA模板上多处与随机引物杂交，在DNA-pol的 化作用下，新链中掺入DIG-dUTP,从而提高标记的灵敏度（高效、高灵敏度）;10;②切口平移法;12;2.单链DNA探针制备;3.PCR合成DNA探针;第一次循环之前于95℃变性7min，随后每次循环的条件是： 95℃变性45s，60℃退火1min,72 ℃延伸2min（一个循环） 用PCR法制备的DIG探针灵敏度高（即使含有很少量的副产物，也会明显影响杂交的特异性；所以在杂交之前，要用凝胶电泳纯化探针） ，数量大;4.寡核苷酸探针的制备;（1）3’端-寡核苷酸探针;（2）3’-端尾部寡核苷酸探针;在寡核苷酸3’-端加上10~100个碱基的尾巴。可提高探针的灵敏度 在标记过程中，末端转移酶可将DIG-11-dUTP加到寡核苷酸的3’-尾端 但探针的尾巴加长，可能会产生非特异性反应。所以在杂交之前，通过一竞争序列（如polyA序列等）“预杂交”，或者改变设计条件等措施可降低非特异性反应（如 P201“b”）;（3）5’端-寡核苷酸探针 在合成待标记寡核苷酸至最后一步时，按固相氨基磷酸盐法，使5’端氨基化，将用氨水处理载体释放的寡核苷酸与DIG反应制成标记于5’端的寡核苷酸探针;5.RNA探针的制备;22;（二）生物素;24;1.切口平移法制备生物素酰化的探针 此法采用生物素-11-dUTP制备探针，每1kbDNA可掺入约50个生物素分子;2.随机引物介导法制备生物素酰化探针;（三）两种新标记法;1.扫若仑标记;29;2.分子灯塔探针;31;分子灯塔探针的熄灭剂可吸收发光剂发射的能量。在室温条件下，分子灯塔的构型可确保发光剂和熄灭剂紧密互补结合，致使荧光基团处于熄灭状态，无荧光产生；一旦当灯塔探针的15个核苷酸与靶DNA或 RNA序列杂交时，其发光剂和熄灭剂便相互分离，产生荧光;三、核素标记;（一）双链DNA探针;35;2.随机引物介导法;（1）以游离DNA片段为模板制备探针;（2）以固定DNA片段为模板制备探针 DNA经电泳后，用EB染色，切下DNA色带，加水后沸水浴使其变性，然后37℃（固定），再加其他试剂室温或 37℃制备探针;（二）RNA探针的制备（体外转录法）;四、标记物纯化;（一）EtOH沉淀法;（二）层析法;五、探针的鉴定;（二）酸沉淀法;（三）色谱法;（四）比色法;（五）发光法;第二节 蛋白质(酶、抗体)标记;49;目 的;一、标记方法;1、酶标记;(1)辣根过氧化酶(HRP)抗体偶联 A 过碘酸盐(periodate)法 原理：HRP是一种糖蛋白，糖链部分无活性，其己糖邻位- OH可被碱性过碘酸盐氧化成醛基，并与IgG中游离-NH2共 价结合成HRP-IgG偶联物 。此酶标抗体可直接使用，或凝胶过滤纯化后使用（是制备酶标抗体的有效方法） B 戊二醛(glutaric dialdehyde)法 原理：先将戊二醛偶联到HRP，用凝胶过滤除去多余的戊二醛，再与IgG偶联；制成的的HRP-IgG偶联物需纯化分离后使用;(2)碱性磷酸酶(AKP)抗体偶联;(3)半乳糖苷酶抗体偶联;(4)HRP与抗-磷酸酪氨酸抗体偶联;2、荧光染料标记;采用荧光染料制备荧光素-抗体偶联的探针的方法;3、生物素标记;(1)生物素标记抗体;(2)生物素标记蛋白质;生物素标记蛋白质的操作 试剂：生物素酰氨基己酸N-羟基琥珀亚胺酯；间隔臂-氨基己酸 操作：所有的试剂要在用时配制，生物素衍生物是溶在重蒸的DMF（二甲基甲酰胺）或DMSO（二甲亚砜）;4、金标记;简要操作;②12nm金粒 在快速