革兰氏染色实验课件.pptxVIP

实验二 革兰氏染色 实验要求 坚持课前预习 不迟到，不早退，更不能无故缺课 严格按照正确规范实验方法进行实验，作好记录 保持实验室整洁 注意安全 实事求是、独立完成实验报告 课程导入 观察上次实验课细菌培养结果 菌落观察：37℃孵育18～24h后观察 1.大小 2.形状 3.表面（光滑？ 湿润？） 4.边缘（整齐？） 5.透明？ 6.颜色（色素？） 手指皮肤细菌 菌落形态 教学目标： 1.巩固和掌握显微镜油镜的正确使用 2.学习细菌革兰氏染色的原理和方法 3.学会显微镜观察细菌的形态 3.对人体微生物染色检查，初步建立无菌操作的概念 显微镜的使用 油镜头的识别和重要参数 油镜的工作原理 油镜的使用方法和注意事项 油镜头的识别和重要参数 放大倍数 数值口径 工作距离 油镜的工作原理 使用油质作为玻片与物镜之间的介质——油浸系 可以增加显微镜的放大倍数 可以增加事业的照明度 可以增加显微镜的分辨率 油镜的使用方法和注意事项 1.用低倍镜对光。 2.低倍镜观察（寻找观察目标），适当缩小光圈。 3.油镜观察，低倍镜找到目标后，物镜转成八字形，在载玻片上滴加一滴香柏油，直接转至油镜，调节细焦准螺旋，使物象清晰，观察记录。最大光圈 4.观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油镜偏位，用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取一张擦镜纸滴加2～3滴酒精乙醚擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净擦镜纸擦去残留的酒精乙醚。 5.将显微镜各部分还原，放回。 革兰氏染色——原理 1）.细胞壁结构不同 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌保留初染时的颜色。 革兰氏染色——原理 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色了，再经复染后就倍染成了红色。 对比图： 革兰氏染色——原理 2）.等电点不同 G+菌的等电点低（pI2～3），G-菌等电点较高（pI4～5），在相同pH条件下，G+菌所带的负电荷比G-菌多，与带正电荷的结晶紫燃料结合较牢固且不易脱色。 3）.形成的复合物不同 G+菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结晶紫和碘牢固地结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而G-菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。 实验材料 1.标本：培养18～24h的学生手指皮肤表面细菌； 2.染色液和试剂：结晶紫，碘液，95%乙醇，稀释石碳酸复红，生理盐水，香柏油，酒精乙醚； 3.器材：载玻片，接种环，酒精灯，显微镜，打火机，擦镜纸等。 革兰染色——方法与步骤 1.制片： 1）.涂片：取一洁净载玻片，按无菌操作方法，接种环灭菌后取生理盐水1～2环于载玻片中央，接种环再次灭菌，冷却后选取平板上单个菌落涂于生理盐水，并用接种环混合均匀，制成薄涂片。 2）.干燥：涂片自然干燥或在酒精灯上方烘干，切忌紧靠火焰，以免标本烤焦，损坏细菌结构，影响镜检。 3）.固定：手持玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次。（以不烫手为宜）。 注意：操作过程中始终贯穿无菌操作观念，要把生物安全放在心里。在新冠疫情的环境下，作为医学生更应该牢记生物安全。 方法与步骤 2.染色 初染 1min 媒染 1min 脱色 （结晶紫） 水洗 （碘液） 水洗 （95%乙醇） 30s～1min 水洗 自然干燥 30s 复染 观察 水洗 （稀释石碳酸复红） 方法与步骤 3.观察 紫色：G+ 1）看颜色 红色：G- 圆形：球菌 2)看形态 杆形：杆菌 弧形：弧菌 结果： G+球菌/ G+杆菌/ G+弧菌； G- 球菌/G-杆菌/ G- 弧菌。 不伪造和编造结果，做人做事实事求是，学术诚信。