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souiq-5诱导鼻咽癌细胞自噬 端粒是真核细胞染色体的自然末端。它在预防染色末期的分解和融合、维护染色体稳定性以及抵制染色末端的复制方面发挥着重要作用。人端粒DNA由5′-(TTAGGG)-3′重复序列和一个3′悬突端(over hang)组成,富含鸟嘌呤重复序列的DNA链能够形成G-四链体。SYUIQ-5是具有吲哚和喹啉结构的白叶藤碱衍生物,我们曾报道它能稳定和诱导G-四链体,并能抑制c-myc启动子和端粒酶活性。自噬是一种进化过程高度保守的细胞行为,是细胞在能量缺乏、代谢等压力下的自我降解过程。自噬不仅具有维持细胞自我稳态、促进细胞生存的作用,过度上调的自噬作用也可以引起细胞死亡,即“自噬性细胞死亡”,也称为Ⅱ型程序性细胞死亡。很多研究表明自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。我们的前期研究发现Atg5敲除能抑制SYUIQ-5介导的自噬和细胞死亡,说明SYUIQ-5通过诱导自噬促进肿瘤细胞死亡。本实验进一步研究SYUIQ-5诱导肿瘤细胞自噬及其分子机制。 1 材料和方法 1.1 血清因子及谷氨酰胺的制备 人鼻咽癌细胞株CNE2、CNE1、HONE1由中山大学肿瘤防治中心保存,用含有10%的胎牛血清、100μg/m L青霉素和100μg/m L链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液培养。细胞在37℃和5%CO2实验条件下培养。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。 1.2 菌株和试剂 胎牛血清购自Gibco公司;化学发光剂(ECL)及Beclin1、FOXO3a抗体购自Cell Signal公司;Akt、p-Akt、BNIP3、GAPDH以及HRP标记的二抗均为Santa Cruz公司产品;LC3抗体购于Novus生物公司,细胞裂解液来自Upstate生物技术公司;BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司;M-MLV来自Promega公司;逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)反应试剂、Taq酶均购自上海申能博采公司;si RNA由上海吉玛公司合成;引物由上海英骏生物技术有限公司合成;白叶藤碱类似物SYUIQ-5由中山大学药学院合成,用100%DMSO溶解,浓度为50μg/m L,-20℃储存备用。 1.3 逆转录pcr 收集经处理的细胞,PBS洗涤2次,加入细胞裂解液100μL,12 000 r/min离心15 min,定量蛋白,取20μg蛋白,加入上样缓冲液,95℃下变性10min。10%~15%的聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后,电转移至硝酸纤维膜上,5%脱脂牛奶封闭后依次加入一抗、二抗,在室温下孵育2 h,TBST缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,p H 7.4,150 mmol/L Na Cl,0.1%Tween20)洗涤3次,每次10 min,暗室ECL显色。 收集经药物处理的细胞,PBS洗涤2次,加入1m L的Trizol(Invitrogen),按照说明书提示的步骤抽提出RNA。在逆转录过程中,先将2μg RNA与0.5μg Olig(d T)混合,加DEPC水定量至15μL,70℃孵育5 min后置于冰上;再加5μL 5×M-MLV反应缓冲液,1.25μL 4×d NTP(10 mmol/L),1μL M-MLV(Promega,200 U/μL),0.625μL RNase OUTTM(40U/μL),并加DEPC水总反应体系调量至25μL,42℃孵育60 min,然后在75℃孵育10 min中止反应。PCR反应过程中,在冰上依次加入反应体系:10×PCR缓冲液(内含有Mg Cl2)2.5μL,4×d NTP(10mmol/L)0.5μL,c DNA 1μL,P1 0.5μL,P2 0.5μL,Taq酶0.25μL,dd H2O 19.75μL。按下列反应条件反应:变性94℃30 s(第一个循环5 min),退火55~68℃40 s,延伸72℃60 s(最后一次循环为10 min),扩增30~35个循环。取10μL扩增产物上样到1.2%琼脂糖凝胶电泳,紫外光下观察摄影。LC3引物序列:上游引物5′-GTTGCTGA CTGACCCTCCA-3′;下游引物5′-CGTCTTTCTCCTG CTCGTAG-3′。BNIP3引物序列:上游引物5′-GAAACAGATACCCATAGCA-3′;下游引物5′-GAACGCAGCATTTACAGA-3′。GAPDH引物序列:上游引物5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′;下游引物5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCAGG TCCACC-3′。 1.5 免疫组化处理 取处于对数生长期的细胞,稀释成3×105