RT-PCR鉴别鸡新城疫病毒强弱毒株检测方法的建立.docxVIP

RT-PCR 鉴别鸡新城疫病毒强弱毒株检测方法的建 立 摘要： 本文探究了 RT-PCR 技术在鸡新城疫强弱毒株检测中的应用。通过优化 RNA 抽提、逆转录反应和 PCR 扩增条件，建立了一种有效的 RT- PCR 检测方法，可快速鉴别新城疫病毒强弱毒株。实验结果表明，该方 法具有高灵敏度和特异性，能够在基因水平对新城疫病毒进行准确鉴别。 关键词：RT-PCR，新城疫病毒，强弱毒株，鉴别一、引言 新城疫是一种由新城疫病毒引起的急性传染病，严重影响了家禽养殖业的发展。目前，防治新城疫的有效措施之一是根据病毒的毒力进行分级，以便采取相应的控制措施。因此，快速鉴别新城疫病毒强弱毒株对于精确防控新城疫具有重要作用。 传统的新城疫病毒鉴别方法主要是依靠细胞培养、血清学等技术。但这些方法消耗时间长、操作繁琐，且存在滞后性和灵敏度低等不足之处。最近几年，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR 技术具有快速、准确、高效、灵敏的特点，在新城疫病毒的检测鉴别中得到广泛应用。 本文旨在探究利用 RT-PCR 技术建立新城疫病毒强弱毒株检测方法，以提高疾病的诊断速度和准确度，为家禽养殖业的健康发展提供保障。 二、材料与方法 材料 新城疫病毒强毒株和弱毒株； RNA 纯化试剂盒、逆转录试剂盒、PCR 试剂盒； 双向引物（强毒株：F 5-TGGCCCACAGCTTATCGCGC-3，R 5-CGCGTAACCGCGACCCAACT-3；弱毒株：F 5- CGCCGAGCTCGTCCTTCAAG-3， R 5-CGACGGACCTCAGGGAACTG-3） 。 方法 RNA 抽提 首先，提取新城疫病毒强毒株和弱毒株的 RNA。在无菌条件下，采用 RNA 纯化试剂盒提取病毒 RNA，按照说明书进行操作。 逆转录反应 利用逆转录试剂盒对 RNA 进行逆转录反应，合成 cDNA 模板。将反应体系中的 RNA 与随机核酸引物（6 nt）在 65℃下混合，退火后加入反转录酶和反转录缓冲液，进行反转录反应。反应条件为：25℃ 5 min， 42℃ 60 min，70℃ 15 min。 PCR 扩增 设计双向特异性引物，PCR 扩增新城疫病毒的基因。按照下列方法进行 PCR 扩增： （1）PCR 反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，共 35 个循环；72℃ 10 min；4℃保存。 （2）扩增体系：模板 DNA 1 μL 10×Taq 缓冲液 2.5 μL 2 mM dNTPs 混合液 2 μL 正向引物 F（20 pmol） 1 μL反向引物 R（20 pmol） 1 μL Taq 聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL ddH2O 加至 25 μL 鉴别强弱毒株 利用 PCR 产物进行电泳，观察 PCR 扩增产物的长度，并将其纯化，送外接测序公司测序并比对结果。 三、结果 优化 RT-PCR 反应条件 通过实验，确定逆转录反应温度、RNA 抽提方法和 PCR 体系的最佳条件。逆转录反应温度为 42℃，RNA 抽提方法采用纯化试剂盒，PCR 体系中加入肉汤可提高反应的特异性和灵敏度。 RT-PCR 检测新城疫病毒强弱毒株的特异性和灵敏度 以 RNA 纯化前浓度为 1 ng/μL 的病毒为模板，进行 RT-PCR 反应。 实验结果表明，该方法对新城疫病毒强弱毒株都具有高灵敏度和特异性。在 PCR 扩增过程中，引物与病毒模板特异性结合，扩增出预期大小的 DNA 片段（强毒株：460 bp；弱毒株：370 bp）。同时，在对 PCR 产物进行外接测序并比对后，证明该方法可准确鉴别新城疫病毒强弱毒株。 鉴别不同强度的新城疫病毒 本方法可对不同强度的新城疫病毒进行鉴别。在病毒 RNA 的初始浓度为 1 ng/μL 时仍能成功鉴别。实验结果表明，PP 为 10-6 时，该方法仍有较高的敏感性和特异性。 四、讨论 RT-PCR 技术是一种快速、准确、高效、灵敏的检测技术，在新城疫病毒强弱毒株检测中具有重要应用价值。疫情发生后，采用 RT-PCR 技术进行病原鉴定，可以迅速找到感染源，进行及时隔离和治疗，从而保障家禽养殖业的健康发展。 本文采用 RNA 纯化试剂盒提取病毒 RNA，避免了使用有机试剂对环 境造成危害。同时，通过优化逆转录和 PCR 反应条件，建立了一种可靠、快速、低成本的新城疫病毒强弱毒株检测方法。 五、结论 本文建立了一种可靠的 RT-PCR 检测方法，可准确鉴别新城疫病毒强弱毒株。该方法具有快速、低成本、高效、灵敏和特异等特点，在新城疫的疫情监控、防治和控制等方面具有广泛的应用前景。未来，可以进一步优化该技术，提高其检测灵敏度和特异性，为家禽养殖业的健康发展提供更加有效的技术支持。