IP实验步骤分析和总结.docxVIP

. . ;. ;. — 原理： IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A特异性地结合到免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。 实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免 染能结合未必能用在 IP 反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。 其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白， 特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活 性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用 弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其 它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使 IP 成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。 再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂， 低温下进行实验。 每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原， 过多则就不能沉降在 beads 上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原， 过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。 IP 实验步骤蛋白