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乳与乳制品常规理化指标检验蛋白质含量的检测 YLNB 2.8 一、凯氏定氮仪常量检测法 原理 样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫 酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的 氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液 中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液 滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。 试剂 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如 未注明其他要求，均指三级水。 浓硫酸 硫酸钾 硫酸铜 氢氧化钠溶液：400g/L 硼酸溶液：30g/L 甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为 95％的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成 1g/L 的乙醇溶液，使用时按 1g/L 溴甲酚绿：1g/L 甲基红为 5：1 的比例混合。2.7 硫酸标准溶液：c (H+)=0.1000±0.005mol/L 2.7.1 标准溶液的配制：取 3ml 浓硫酸加到 15ml 水中，冷 却后洗入 1000ml 容量瓶中，定容。 2.7.2 标准溶液的标定：（见 GB/T601-2002） 3 硫酸铵：干燥后最低含量 99.9%，使用前直接将硫酸铵在 102±2℃干燥至少 2h，在干燥器中冷却至室温。 仪器及器材 凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及 电位滴定仪 消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1） 接收瓶：300ml 三角瓶或烧杯 方法 样品称取 原料奶和纯牛奶样品：称取约 5g 乳饮料：称取约 8g 冰淇淋：称取约 5g 乳粉：称取约 0.5g 测量 消化 将上述样品称入消化管中，同时称取5g 硫酸钾，0.5g硫酸铜，然后加入 15-20ml 浓硫酸，将消化管放入消化炉中， 将温度旋钮设定在大约 6 档左右，连接好排气装置并打开开关，开始进行消化，消化 30 分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至 9 档，继续消化直到消化液透明。 消化至呈透明的蓝绿色后，继续消化至少 1 小时。在此过程中消化液必须沸腾。 注：决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室 用仪器测量一个特定 得样品所得到大量数据，一般选择一个高蛋白，高脂肪的牛 奶样品，在透明后用不同的沸腾时间（1-1.5h）测定它的蛋 白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加，逐渐趋于恒 定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋 白质的沸腾时间。 消化结束后，消化液应是透明的。将消化管连同排 气盖从消化器上移走，冷却到室温，冷却的消化液应是液体 或在管底有少量的结晶体的液体。 注：大量的结晶体可能是消化过程中酸损失的结果，它能导 致检测结果偏低。为 了减少酸的损失，可降低烟吸出的速度。 消化液冷却至室温后，移走排气盖，在每个管中慢 慢加约 20ml 水，摇动呈旋涡状使其充分混合，保证分离出的结晶体全部溶解，再冷却到室温。 蒸馏 把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中，在冷凝器出口 的下面放置一个接收瓶，还要把连接管放到接收瓶底端，编 辑蒸馏程序，设定硼酸 50ml，氢氧化钠 65ml，蒸馏时间 3 —5min。 注：蒸馏时间是根据接收液的体积达到 200ml 而得到的。 滴定 用pH 为 7.00 和 4.00 的缓冲溶液校准电位滴定仪。 设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终 点设为 4.60，并开始滴定。 记录结果。 空白试验 按照 4.2.1—4.2.3 所写的步骤进行空白试验，在消化管中加入 0.85g 蔗糖，加入蔗糖的作用是使空白在消化过程中与样品消耗等量的硫酸。 回收试验 方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查， 按照 4.1.1—4.1.3 的步骤进行。 用 0.12g 硫酸铵加 0.85g 蔗糖进行测定。回收率应大于 99％。 4.4.3 用 0.18g 色氨酸或 0.16g 盐酸赖氨酸（5.9）加 0.67g 蔗糖进行测定。回收率应大于 98％。 4.4.4 在以上的两个回收试验中（4.4.2 和 4.4.3），低结果将说明过程失败和（或）硫酸标准溶液的浓度不准确。应检 查凯氏定氮仪或重新标定硫酸标准溶液。 结果计算 氮含量的计算 ? ? ? ? 样品中氮含量（g/100g）= 其中： V ? V ? C H? ? 0.014 0 ?100 m V ——测定中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 V —— 空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 0 c (H+) ——硫酸标准溶液 H+的摩尔浓度，mol/L。m——样品质量，g。 四舍六入的结果保留到 0.01%。 蛋白质含量的计算 蛋白含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以 6.38 即可。 5.3 回收率的计算 用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量 21.19％即可。6.允许差 同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的 1.5％。