人胱抑素C可溶性表达、多克隆抗体制备及检测方法的建立的中期报告.docxVIP

人胱抑素C可溶性表达、多克隆抗体制备及检测方法的建立的中期报告 中期报告 一、研究背景 人胱抑素C (Cystatin C, CST3) 是一种由三十三个氨基酸组成的低分子量蛋白质，分子量约为 13 kDa。其主要分布在体内液体中，如血液、尿液、脑脊液等。与此同时，人胱抑素C 具有强大的蛋白酶抑制活性，在细胞代谢和免疫调节等方面发挥着重要的生物学功能。近年来，随着生物技术的发展，人胱抑素C 作为一种重要的生物标志物已受到广泛关注。 二、研究目的 本研究旨在建立人胱抑素C可溶性表达、多克隆抗体制备及检测方法，为深入研究其在各种疾病中的生物学功能提供技术支持。 三、研究内容及进展 1. 客体基因克隆 利用 RT-PCR 从人肝组织中克隆了人胱抑素C全长基因。所得 PCR 产物经酶切和测序验证，确保其与目标序列完全一致。 2. 可溶性表达载体构建 选用 pET28a 基因工程载体，在 N-末端加入 6×His 标签，在 C-末端加入 thioredoxin (TRX) 和 SUMO 融合表达结构域，构建出可溶性表达载体 pET28a-CST3。 3. 可溶性表达蛋白表达及纯化 将 pET28a-CST3 转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中，利用 IPTG 诱导表达。通过 SDS鉴定，发现表达蛋白质量约为 33 kDa，与预期大小相符。接着采用 Ni-NTA 离子交换层析法进行亲和纯化