5种结核杆菌耐药基因突变的研究.docxVIP

5种结核杆菌耐药基因突变的研究 本研究通过pcr-scp技术建立了一种检测m.t5类药物遗传因素的方法，分析了134例临床抗生素植物的突变，并对m.t类药物突变与m.t类药物的内在联系进行了探讨。 pcr扩增聚合酶链反应分子检测 标本来源:M.tb标准株(H37RV)由中国药品生物制品检定所提供,134例临床耐药株源于我院住院患者痰标本。 试剂:M.tb耐药基因检测试剂由本院结核病分子生物学实验室提供。7H10培养基由美国BD公司提供。 方法:患者痰标本一部分经Bacter-960培养后提取DNA,至-20℃保存备用。另一部分进行7H9培养基梯度药敏试验。吡嗪酰胺(PZA)、链霉素(SM)、利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)在培养基内药物含量的高浓度分别依次为250、4.0、400、2.0、50mg/L(高耐药性)。 低浓度含量分别依次为50、0.4、40、0.2、5mg/L(低耐药性)。 聚合酶链反应(PCR)扩增:利用我院自行研制的rDNA PCR扩增试剂,在25μl反应体系中,4×dNTP的终浓度各为0.2μmol/L,引物Ⅰ、Ⅱ的终浓度各为0.3μmol/L,纯化的DNA模板5~25ng,Taq DNA聚合酶1U。在DNA热循环仪内,按94℃变性50s→58℃退火1 min→72℃延伸1 min。扩增35个循环,最后72℃延伸7 min。取3μl扩增产