基因克隆载体的种类和特性.pptVIP

3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr or Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。 本文档共74页；当前第30页；编辑于星期二\12点21分 5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 本文档共74页；当前第31页；编辑于星期二\12点21分 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码的5‘-端可允许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大 注：X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷） IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷） 本文档共74页；当前第32页；编辑于星期二\12点21分 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β LacZ基因的结构与产物 pUC18 BamHI片段 重组DNA分子 转化 E.coli 外源 DNA BamHI片段  涂布在含X-Gal 和Amp的平板上, 白色菌落为重组 子，兰色菌落为 原载体 利用LacZ基因筛选重组子 本文档共74页；当前第33页；编辑于星期二\12点21分 质粒的选择性标记 本文档共74页；当前第34页；编辑于星期二\12点21分 （三）质粒的分类 1、根据质粒基因编码的特性分五大类： A、致育质粒（fertility plasmid)/F-质粒：只含有转移基因（tra-)，除了促进接合转移外没有其他功能。 B、抗性质粒（resistance plasmid)/R质粒：含有氯霉素、青霉素或水银抗性基因。如RP4质粒，发现于假单胞杆菌。 C、Col质粒（col-plasmid)：编码大肠杆菌毒素（colicine)，可以杀死其他细菌，如存在于E.coli中的CoE1质粒。 本文档共74页；当前第35页；编辑于星期二\12点21分 D、降解质粒（Degradative plasmids)：可以降解特殊的分子，如：甲苯、水杨酸。 E、致瘤质粒（Virulence plasmids)或叫烈性质粒：可以使宿主细菌变成病原体，如根癌农杆菌的Ti质粒。 本文档共74页；当前第36页；编辑于星期二\12点21分 2、人工构建的质粒据功能及用途可分为六大类： A、多拷贝质粒：复制子经过人工突变，除去控制拷贝数的负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 B、测序质粒： C、整合质粒：装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上。 D、穿梭质粒：含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制。 E、表达质粒：装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达。 F、探针质粒：筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动子、终止子等。 本文档共74页；当前第37页；编辑于星期二\12点21分 （四）实验室常用质粒举例 1、pBR322： 该质粒的优点： 1）分子大小4363bp，比较小、容易纯化。 2）含有2个抗生素抗性基因,ampR和tetR,可以作为选择标记。 3）受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一