质粒提取、定量与酶切鉴定ppt课件.pptxVIP

质粒DNA的提取、定量 与酶切鉴定 Extraction and Identification of Plasmid DNA 实验流程图 四、酶切产物的琼脂糖电泳检测 一、碱裂解法提取质粒 三、质粒酶切 二、质粒定量 实验目的 • 掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定DNA的方法 • 了解质粒酶切鉴定原理 • 掌握琼脂糖凝胶电泳技术 • BioWest电泳琼脂糖干粉 • 0.5×TBE核酸电泳缓冲液 • EB 核酸荧光染料 • Takara 6 × 电泳上样缓冲液 • Takara EcoRI 限制性内切酶 • Takara Hind III 限制性内切酶 • Takara 10 × M 酶切缓冲液 • 大肠杆菌DH5a菌株 • pMD18-T载体 • 易瑞质粒小量提取试剂盒 实验材料 实验仪器 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的 差异而达到分离目的。 染色体DNA：氢键断裂， 变 性。 质粒DNA：大部分氢键断裂， 但超螺旋共价闭合环状的两 条互补链不会完全分离。 ( 不完全变性) 质粒DNA：复性，溶于溶液中 染色体DNA：不能复性；形成缠连 的网状结构。 染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来 碱裂解法基本原理 pH =12.6 (碱性) (pH4.8) NaAc溶液 pH=中性 离心 u 溶液S1 (细菌悬浮液) u 裂解液S2 u 中和液S3 u 洗涤液W u 洗脱液 u RNase A(100mg/ml) u DNA吸附柱 溶液S1： 50 mmol/L 葡萄糖 10 mmol/L EDTA 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 2毫克/毫升 溶菌酶 裂解液S2：200 mmol/L NaOH 1% SDS 中和液S3：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 试剂盒的组成： 12 ，000rpm 600μl 30s 弃滤液 洗涤液W 12000rpm 1.5mL 菌液 1 min 菌体沉淀 取吸附柱至 50μl 另一新EP管 洗脱液 温和地 颠倒混匀6-8次 实验流程 至出现白色 絮状沉淀 室温静置 3~5min 收集洗脱液备用 取600pl上清至 吸附柱管 12 ，000rpm 1 min 12 ，000rpm 2 min 12 ，000rpm 10 min 颠倒混匀4-6次 1. 收集细胞 3. 裂解细胞 2. 悬浮细胞 5. 过柱分离 250μl 溶液S1 12 ，000rpm 30s 12 ，000rpm 30s 室温静置 1min 剧烈震荡 中和液S3 洗涤液W 6. 洗柱 4. 中和 7. 洗脱 弃滤液 空柱 裂解液S2 弃滤液 350μl 250μl 600μl 利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性 二、质粒DNA定量测定 紫外分光光度计 基本原理 操作步骤 1. 取5 l提取的质粒DNA，加入95 l蒸馏水 2. 混合均匀 3. 用紫外分光光度计测定A260 DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA (或RNA 20μg/ml寡核苷酸 紫外光吸收法： ) DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 DNA或RNA的纯度判定 三、质粒DNA的酶切分析 • 质粒 DNA: ~3 kb 载体: pMD18-T 2.7kb 基因: CHD5 1.4 kb 限制性内切酶 • 限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的 特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切 割双链DNA。 • 分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为4 ~6个核苷酸的反向重复序列。 GGATCC CCTAGG EcoRⅠ和HindⅢ的识别序列和切口是： • EcoRⅠ：G↓AATTC • HindⅢ：A↓AGCTT pMD18-T 反应物 体积(µl) 10× M 酶切缓冲液 2 质粒DNA 10 Hind III 1 EcoR I 1 H2O