几十次药物结合蛋白的DARTS实验经验总结（包括实验结果分析和各种成败细节）.pdfVIP

几十次药物结合蛋白的DARTS 实验经验总结（包括实验结果分析 和各种成败细节） DARTS 实验原理：小分子配体与靶蛋白结合后可以稳定靶蛋白，增强其对蛋白水解酶水解 作用的抗性。简而言之就是小分子药物结合蛋白质后，水解酶水解该蛋白时更难被降解了。 实验步骤：1、蛋白液的制备；2、小分子药物和蛋白孵育 （实验分组）；3、链霉蛋白酶与蛋 白复合物孵育；4、免疫印迹、考马斯亮蓝染色和银染等。 实验中涉及主要试剂：链酶蛋白酶（上海源叶公司），小分子药物茯苓酸 PA ，293T 细胞， 六孔板，蛋白表达质粒，转染试剂PEI ，BCA 蛋白浓度试剂盒（索莱宝），金属加热模块等。 一、实验过程 1. 制备蛋白悬液。 因为最开始已经通过其他方法筛出A 蛋白和B 蛋白与小分子PA 结合，因此进一步验 证它们是否结合，我采用在293T 细胞过表达A 蛋白和B 蛋白制备蛋白悬液。过程如下： 1) 转染：种板 （6 孔板）后第二天细胞融合度达到70-80%时转染 （我通常在种板后第 二天上午九点左右转染，融合度达不到70%，甚至50%我也转，收细胞时候量会少 一些），每孔转染质粒 1000 ng ，转染试剂 PEI ，转染比例 1:3，分别取 500ul opti- MEM 无血清培养基加入两个1.5ml EP 管中，一管加入转染试剂，混匀静置3-5min ； 另一管加入质粒，并将静置好的转染试剂加入其中，混匀静置20min 。收集原六孔 板中培养液于15ml 离心筒中（还可以重复利用，别浪费）并补满至12ml ，封口膜 封好置于37℃培养箱（使培养基温度37℃ ），然后混匀静置好的质粒和转染试剂轻 柔沿壁缓慢加入，4-6h 后弃掉，换成放入培养箱的完全培养基。 2) 收集细胞：培养24-48h 后（我一般是24h ，也就是转染完第二天上午十点左右）， 置于冰上；我一般是每个孔加入360ul RIPA ，配置含蛋白酶抑制剂的RIPA 溶液置 于冰上；弃去六孔板上清液，用冷PBS 洗两遍，每孔加入360ul RIPA ，冰上静置裂 解5min，用细胞刮刮下细胞收集于1.5ml EP 管，冰上静置裂解15min ，4℃离心机 12000 rpm 离心15min ，吸取上清于新的1.5ml EP 管 （这一步有可能出现离心之后 看不到沉淀，这种情况可以多裂解一会儿，适当提高离心时间）。 3) 测蛋白浓度（目的是为了计算链酶蛋白酶加入量） BCA 试剂盒测量，我做了很多次，蛋白量六孔板每孔大概在200-300 ug/ml 范围， 偶尔也有一百多和四百多，就以300ug/ml ，360ul 举例。 2. 蛋白与小分子药物孵育 1）计算小分子药物用量：前期实验PA 处理细胞浓度为 100nM ，因此处理过程中选择 100nM 。PA 分子量为528 ，先配置100ul ，200mM 母液浓度，主要是为了好计算称 量，可以使用等比缩小的方法计算，称量约11mg 的PA 溶于DMSO 中 （PA 不溶于 水），然后再稀释成200uM ，20uM 和2uM 浓度，分别分装在不同管每管100ul ，减 少反复冻融。 2 ）蛋白和小分子药物孵育：将蛋白悬液360ul ，平均分成三份，每份120ul ，取2uM 的 PA 加入6ul 使终浓度为100nM ，实验设计如下，最左侧空白对照加入DMSO ，右边 两个样品每管各加入6ul （设计三个组，最左边为空白对照，中间的为酶解对照，最 右边为酶解组）。加入PA 后混匀，25℃孵育一个小时。 A-Flag + + + PA - + + 3. 链酶蛋白酶与蛋白复合物孵育 （酶解）：设计实验如下 A-Flag + + + PA -