DB51T 2469-2018鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程.docxVIP

1 ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2469—2018 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发 布 I DB51/T 2469—2018 目 次 前 言 II 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 试剂和材料 1 5 设备和器械 2 6 临床检查 2 7 实验室样品采集 2 8 细菌分离与纯化 2 9 细菌鉴定 2 10 结果判定 4 11 综合判定 5 附录 A（规范性附录） 试剂配方 6 附录 B（资料性附录） 海豚链球菌 lctO 基因参考序列（870bp） 9 II DB51/T 2469—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、郑李平、黄小丽、陈德芳、欧阳萍、雷雪平、曹师琪。 1 DB51/T 2469—2018 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鲟鱼海豚链球菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器械、临床检查、实验室 样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于施氏鲟 (Acipenser schrenckii) 、西伯利亚鲟 (Acipenser baerii) 、俄罗斯鲟 ( Acipenser gueldenstaedtii ) 等鲟鱼海豚链球菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 鲟鱼海豚链球菌病 指由海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染引起的鲟鱼发病或死亡的一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基。 3.3 基因 lctO lactate oxidase 乳酸氧化酶基因。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液与培养基 2 DB51/T 2469—2018 按 GB/T 4789.28、GB/T 18652、SC/T 7014 规定执行。Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg2+ ）、 DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂， 上述未提及的见附录 A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。 4.3 引物 lctO基 因 序 列 扩 增 引 物 ， P1-F ： 5-AAGGGGAAATCGCAAGTGCC-3, P2-R ： 5-ATATCTGATTGG GCCGTCTAA-3 - 20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、 恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水 平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼摄食减少或停止摄食，体色发黑，游动缓慢，偶见间隙性的狂游或旋游。 6.2 外部检查 病鱼体表、胸鳍基部、口腔周围出血， 肛门红肿， 外突； 部分病鱼腹部膨大， 体表出现溃疡， 或无 明显外部病变。 6.3 剖检 肝肿大， 发黄， 质地变脆， 或弥散性出血， 呈花斑状； 脾、 肾肿大， 呈紫色； 肠道充血， 肠壁变薄， 肠腔内充满黏液；脑肿胀，脑膜淤血；部分病鱼腹腔内积有淡红色腹水；鳃与其他组织无明显病变。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 的规定执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中， 从病鱼的肝、肾及脑中直接取样， 按常规法划线接种脑心浸液琼脂培养基（Brain Heart Inf