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双荧光素酶检测的原理和应用 双荧光素酶检测的原理和应用 一、荧光素酶报告基因的检测原理 荧光素酶（Luciferase）是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自 然界能够发光的生物。 自然界存在的荧光素酶来自萤火虫、发光细菌、发光海星、发光节虫、发光鱼、发光甲虫等。细菌荧光素酶对热敏感，因此在 哺乳细胞的应用中受到限制。目前，以北美萤火虫虫(Photinus pyralis)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛，该基因可编码550 个氨基酸的荧光素酶蛋白，是一个61kDa 的单体酶，无需表达后修饰，直接具有完全酶活。 发光机制 生物荧光实质是一种化学荧光。萤火虫荧光素酶在Mg2+、ATP、O2 的参与下，催化D2 荧光素(D2luciferin) 氧化脱羧，产生激 活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～580 nm 的荧光，其化学反应式如下。 这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。 这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光，其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素酶是靠酶和底物的相互反应 发光，特异性很强，灵敏度高，由于没有激发光的非特异性干扰，信噪比也比较高。 二、荧光素酶报告基因的检测流程 1、重组质粒制备: 制备含有待检测基因-Luc/Rluc 的重组质粒； 2、细胞系选择: 根据实验需要选择细胞株，通常选择转染效率较高的293T 细胞或原代细胞等； 3、共转染: 将带有Luc/Rluc 标记的报告基因和目的基因进行共转染，设置不同的检测时间点，一般为24h/48h； 4、外界干预: 转染后，可进行物理/化学/病毒等的相应刺激； 5、细胞处理: 采用进口/国产双荧光素酶检测试剂盒依照protocol 操作； 6、荧光检测: 使用GENios Pro 酶标仪或具有类似检测功能的设备进行荧光强度检测。 三、荧光素酶报告基因的优点 1、优越的灵敏度，比Westernbloting 灵敏度高 1000 倍以上； 2、内源性低，哺乳动物无内源性表达； 3、荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响； 4、发光检测，检测方便； 5、灵敏度高，10‐20 摩尔荧光素酶分子； 6、检测范围广，大于 7 个数量级。 双荧光素酶检测结果示例 四、主要应用领域 1、潜在启动子/启动子核心区域检测； 2、潜在增强子/抑制子等调控子核心元件检测； 3、启动子区可能的转录因子结合位点检测； 4、启动子/增强子与转录因子的相互作用； 5、病毒/细胞相互作用； 6、药物等化学诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）； 7、射线等物理诱导因素对启动子活性的调节（抑制或增强）。 五、荧光素酶报告基因检测方法与Western-Blot 检测方法在细胞信号转导通路调控机制研究中的区别 1、荧光素酶报告基因检测是测定上游刺激对下游靶基因在转录水平的影响，即对靶基因mRNA 表达水平的影响，可以通过实时 荧光定量PCR 来验证；Western blot 是测定上游刺激对下游靶基因对应的蛋白表达水平的影响，特别是磷酸化程度的改变。因此，两方面的实验结果可以结合起来更细致、更全面地揭示细胞信号转导调控的分子机制。 2、荧光素酶报告基因检测方法操作过程相对简单，检测灵敏度较高；Western blotting 操作过程繁琐，检测灵敏度较低。 3、荧光素酶报告基因检测只需要成功将含有目标DNA 序列插入到报告载体中，即可进行后续实验，Western blotting 则需要购买商品化的一抗，一般价高量少，且抗体的杂交条件需要摸索；若自制的一抗，抗体效价需要验证，实验周期较长。 六、参考文献 Pan, Y., R. Geng, N. Zhou, G. F. Zheng, H. Zhao, J. Wang, C. M. Zhao, X. B. Qiu, Y. Q. Yang and X. Y. Liu (2015). TBX20 loss-of-function mutation contributes to double outlet right ventricle. Int J Mol Med. Sterling, L., M. Walter, D. Ting and B. Schule (2014). Discovery of functional non-coding conserved regions in the alpha-synuclein gene locus. F1000Res3: 259. Xu, Xu, R. X., R