生理学细胞膜离子通透性的测定.docxVIP

细胞膜离子通透性的测定——电压钳实验 早在1902年，Julius Bernstein就提出膜学说用以解释生物电的产生机制，认为细胞膜 两侧带电离子的不同分布和跨膜扩散是产生生物电的基础。但直到1939年英国科学家Alan Hodgkin和Andrew Huxley在枪乌鲗巨神经轴突横断面上插入0.1mm直径的微电极才第一 次真正记录到了静息电位。由于他们测得的细胞内电位数值和K+的平衡电位非常接近，从 而证实了 Bernstein膜学说中关于静息电位产生机制的推断，即在安静情况下细胞膜对K+通 透性较大，K+外流是静息电位产生的主要原因。然而，Hodgkin和Huxley在接下来记录细 胞受到刺激发生动作电位的实验中发现，动作电位的幅度大大超过了零电位，表现为膜电位 的倒转。这一现象无法用Bernstein膜学说中提出的动作电位是膜对各种离子通透性普遍增 大而使静息电位暂时消失来解释，因为这样的解释，其结果是膜电位变为零。Hodgkin和 Huxley发现，用葡萄糖或氯化胆碱等张地替代细胞外液中Na+时，动作电位幅度会随着细胞 外液中Na+的减少而降低；又考虑到动作电位的超射值(+30?+50mV)接近经公式计算的 钠平衡电位 (+50?+70mV)。Hodgkin和Huxley由此认为:动作电位发生时膜对Na+的通透性瞬间增大， 并远超过对K+的通透性，动作电位的去极化和复极化时相可能是膜对Na+和K+的通透性发 生选择性改变的结果。然而，如何能够直接观察动作电位期间膜对Na+和K+通透性的变化 呢？ 20世纪40年代后期，Hodgkin和Huxley设计并成功地在枪乌鲗巨轴突上进行了著名 的电压钳(voltage clamp)实验。他们通过测定跨膜离子电流来观察膜通透性的改变，证实 了膜对Na+和K+通透性的相继改变是形成动作电位的离子基础。由于这一贡献，Hodgkin 和Huxley共同获得了 1963年的诺贝尔生理学和医学奖。 Hodgkin和Huxley通过测定膜电流来反映膜对离子通透性的改变，其设计依据是欧姆 定律。因为从电学角度看，离子跨膜移动可形成离子电流(Iion)，膜的通透性即是离子通 过膜的难易程度，可用膜电阻(R)或其倒数膜电导(Gion)表示，推动离子跨膜移动的动 力则是由电位差和浓度差决定的该离子的电-化学驱动力，可用膜电位和离子平衡电位的差 值(Vm - Eion)来表示。根据欧姆定律，Iion = Gion .(Vm - Eion)，如果将驱动力Vm - Eion 加以固定，离子电流Iion的变化即可用来表示膜电导Gion或膜通透性的变化。然而，在动作 电位期间，尽管Eion因离子移动量少不会发生显著变化，但膜电位Vm则可发生快速显著的 变化，如从-65mV改变为+30mV，这就使离子跨膜移动的驱动力Vm - Eion发生了显著变 化，从而使测量所得的离子电流Iion的变化便失去了意义。 在测定膜电流时如何能使膜电位Vm保持不变？ Hodgkin和Huxley在电压钳实验中，巧 妙地应用了 Kenneth Cole在1940年发明的电压钳技术，实现了膜电位的固定。“钳” （clamp）即是固定的意思。电压钳实验的基本原理如图1所示，在被钳制的枪乌鲗轴突横 断面上插入两根微电极（此为双电极电压钳，以后的电压钳技术通过快速的开关转换只需一 根电极也能完成双电极的功能），一根是记录膜电位的电极E，，通过放大器（X1）输入到示 波器监测膜电位Vm。同时，将信号（Vm）输入到反馈放大器（FBA），与另一个指令电位 （钳制电位）VC进行比较。当两者电位相等时（如钳制电位等于静息电位），反馈放大器 的输出电流为零；当两者出现差异时（如钳制电位突然由静息电位改变为0mV，相当于一 个刺激），FBA将输出一个电流，经电极T向细胞内注入。该电流流过细胞膜产生的电位差 使新的膜电位趋向于钳制电位VC，当新的膜电位达到钳制电位水平时，反馈放大器的输入 端因无电位差而注射电流便停止。如此，便构成一个使膜电位Vm始终跟随或等于钳制电位 VC的反馈电路。该装置之所以称为“电压钳”，正是因为它能将膜电位“控制”或“钳制” 到任何想要的水平。这种由改变钳制电位产生的注射电流通过细胞膜的阻容耦合电路时可首 先记录到的一个由膜被动特性决定的电容充电电流或称刺激伪迹。重要的是，当细胞固定于 某一钳制电位VC时，如果膜电导Gion在此时发生改变，就会出现随Gion而变化、能够反映 Gion改变的跨膜离子电流Iion。同样地，电压钳反馈电路也会极其灵敏地探测到由于跨膜离 子电流Iion出现而改变的膜电位，并发生快速反应，经电极【注入与跨膜离子电流Iion同样大 小但方向相反的电流（上述充电电流或刺激伪迹之后记录到的电流），以精确地对抗跨