流感禽流感实验室诊断及新技术新进展详解演示文稿.pptVIP

荧光PCR结果－阳性样品本文档共78页；当前第31页；编辑于星期日\17点34分荧光PCR结果－阴性样品本文档共78页；当前第32页；编辑于星期日\17点34分荧光PCR结果－可疑样品本文档共78页；当前第33页；编辑于星期日\17点34分病毒分离-MDCK细胞标本接种MDCK细胞每日观察细胞病变(CPE)MDCK细胞收获33－35℃培养本文档共78页；当前第34页；编辑于星期日\17点34分接种流程清洗MDCK细胞临床采样标本接种细胞Hank’s液清洗细胞，一般清洗2遍33－35度吸附1－2小时Hank’s液清洗细胞加入病毒生长液，33－35度培养箱培养24小时后，观察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获（细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临床标本流程图本文档共78页；当前第35页；编辑于星期日\17点34分MDCK细胞病毒分离CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关每日观察细胞病变(CPE)标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA试验阴性者，继续盲传1～2代后，HA试验仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴性，标本可弃去本文档共78页；当前第36页；编辑于星期日\17点34分细胞病变图本文档共78页；当前第37页；编辑于星期日\17点34分鸡胚病毒分离标本接种于9日龄鸡胚33℃～35℃培养72小时检卵标本准备本文档共78页；当前第38页；编辑于星期日\17点34分本文档共78页；当前第39页；编辑于星期日\17点34分鸡胚分离方法-试剂准备1)?????9～11日龄鸡胚2)?????照蛋灯3)?????70%～75％酒精4)?????1ml一次性注射器5)?????鸡蛋开孔器6)?????无菌胶布或蜡7)?????10ml试管和试管架8)?????10ml移液管或1ml移液器及无菌吸尖9)?????无菌镊子10)无菌眼科剪本文档共78页；当前第40页；编辑于星期日\17点34分鸡胚分离方法-标记鸡胚■检视标记鸡胚◆用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限◆标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置◆如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉本文档共78页；当前第41页；编辑于星期日\17点34分■接种病毒方法◆单腔接种盲种◆双腔接种灯下接种开窗接种鸡胚分离方法本文档共78页；当前第42页；编辑于星期日\17点34分鸡胚分离流程（1）◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm窗口◆用注射器吸200μl处理过的临床标本，装上16号针头◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μl标本。将针头退出至?寸，将另外100μl标本注入鸡胚尿囊腔本文档共78页；当前第43页；编辑于星期日\17点34分鸡胚分离流程（2）◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚◆将针头弃于合适的生物安全装置中◆用消毒过的医用胶布封口◆33～35oC温箱培养鸡胚2～3天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去本文档共78页；当前第44页；编辑于星期日\17点34分鸡胚分离流程（3）■收获尿囊液和羊水■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时■标记15ml无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致■用70%～75％酒精消毒鸡胚顶