凝胶迁移实验.docxVIP

凝胶迁移实验（EMSA）

【EMSA实验原理】：如上图所示，DNA-复合物比非结合的探针移动得慢；当检测DNA结合蛋白，可用纯化蛋白、部分纯化蛋白或核细胞抽提液；竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA片段和寡核苷酸片段（特异）和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA结合蛋白的特异性；在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

实验步骤

探针的标记→探针的纯化→EMSA胶的配制→EMSA结合反应→电泳分析。

四大关键因素

一、实验设计

用药品刺激细胞时，设计的药品浓度和时间梯度的问题，这个很关键！

【建议总结】：

一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！

二是用药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程。时间可以长一些，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点。

二、核蛋白样品的制备

注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像；

掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度。能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是比较高的!一般要求在1ug/ul以上！有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果。这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。

同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。而组织抽提后杂蛋白相对较多！杂蛋白多会不容易得到EMSA阳性结果！

三、探针的制备

生物素标记到3’端还是5’端？其实我觉得最好还是两端都标记，这样才能更好的提高灵敏度，其制作程序如下：合成寡核苷酸标记生物素纯化退火合成双链。也是一个比较复杂的过程。（在ＥＭＳＡ操作中会用到同位素，要注意实验室环境和实验员的保护）

四、EMSA实验技术要点

制胶

必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶。制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果。

10XTBE1.0ml

40%Acrylamide（40%聚丙烯酰胺）3.3ml

50%Glycerol（50%甘油）1.0ml

dH2O（蒸馏水）14.8ml

TEMED（四甲基乙二氨）20μl

脱气10min

10%AP（过硫酸氨）120μl

总量20.0ml』

探针用量

这相当于10-50fmoles的DNA探针，我们通常是最少50fmol。

蛋白样品用量

一般用量在2-20ug(控制在1-5μl)蛋白，总体系15ul。细胞核抽提物浓度都比较低，组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多。

预电泳和电泳

0.25XTBE在冰上120V预电泳1小时;务必换掉预电泳的缓冲液,用新的0.25XTB低温下150V，电泳约60分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!

电转运

在0.5XTBE中390mA电转移40分钟,注意转运膜的选择,有一种离子加强型的转运效果比较好!我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!

紫外交联

正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!

化学发光反应

包括BlockingBuffer30分钟封闭,Streptavidin-HRP标记,WashingBuffer洗涤;EquilibrationSolution平衡,这些按照规定操作即可!没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混匀后在将膜放在液体中孵浴。

化学发光图像显示

两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和Western试验操作相当,只是这个膜是一次性的,不能重复使用,一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线,这个很正常!