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基因编辑细胞系常见问题解答

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一、基因敲除细胞系的构建

1.基因敲除的sgRNA如何设计？

在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA（smallguideRNA，sgRNA）通过碱基互补配对原则引导Cas9蛋白酶

至基因组特定的靶序列上，Cas9蛋白与PAM序列结合后便可对靶位点进行切割，形成DNA双链切口。

sgRNA设计的合理与否，对于CRISPR-Cas9编辑系统的切割效率，甚至最后能否得到KO细胞具有重要影

响。目前虽然有诸多高效快速的gRNA设计工具，但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。

sgRNA的设计需要遵循以下原则：

(1)不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域，且能影

响蛋白的功能结构域。

(2)尽可能影响所有的转录本，敲除位点最好在编码区的前50%，但避免敲除ATG所在外显子或ATG之

前的外显子。

(3)片段敲除的sgRNA设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后

序列尽量简单，方便后续的PCR鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非3的倍数，使靶区域后面

的序列发生移码。另外，片段敲除所选定的敲除区域不要超过10Kb，超过10Kb后编辑敲除效率会降

低。

(4)在设计sgRNA时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点等信息。

例如靶点的GC%尽量不要低于40%，靶点序列GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不

要有连续4个以上的T碱基，避免形成RNAPolIII的转录终止信号等。

2.如何避免脱靶效应？

研究表明，sgRNA通常会与基因组DNA发生一定概率的序列错配，从而引起非预期的基因组编辑，即

所谓的脱靶效应（Off-targeteffects）。为了尽可能避免脱靶效应，可以通过以下几点进行优化：

(1)提高sgRNA特异性。在设计sgRNA序列时，可选择GC含量在50%~70%，与靶基因序列之外的基因

组DNA同源性较低的sgRNA序列，同时还可以选择在sgRNA的5’端增加2个鸟嘌呤，来提高sgRNA

的特异性。

(2)控制Cas9-sgRNA用量。通过控制Cas9蛋白或sgRNA的表达量来减少脱靶效应，细胞中持续表达Cas9

将增加脱靶风险，因此可以通过Cas9蛋白的抑制剂来降低Cas9活性，降低脱靶效应。尽管通过调节

sgRNA和Cas9浓度可降低脱靶风险，但浓度降低后，相应的基因组编辑能力也会减弱，要根据实际情

况选择合适的gRNA和Cas9复合物比值。

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(3)改造Cas9。通过对野生型Cas9进行改造提高CRISPR-Cas9系统的特异性，可将Cas9中的一个酶切位

点失活，得到突变型切口酶，由于突变型Cas9只能对单链进行切割，因此需要2条sgRNA同时引导，

在DNA不同的链产生2个相近的切口，才能引起双链DNA断裂。只有2条sgRNA均发生错配时才会

发生脱靶，这极大降低了脱靶效应。

(4)选择合适的递送载体。目前Cas9可以通过DNA质粒、病毒和蛋白质三种方式传递到靶细胞中，利用

Cas9/sgRNA核糖核蛋白（ribonucleoproteins，RNPs）递送系统不会在被编辑的细胞基因组中插入外源

DNA序列，可有效减少脱靶效应。

3.如何检测脱靶？

一直以来，CRISPR系统的脱靶效应尚未得到有效的解决，因此对于脱靶效率的检测也有不少研究。

针对细胞外的检测方法有：

(1)Digenome-seqDigestedgenomesequencing，通过Cas9核酸酶体外切割后提基因组DNA，进行高通量测

序，鉴定脱位点，生物信息学分析来检测脱靶情况。

(2)CIRCLE-seq，将基因组片段化之后自连接环化，然后用Cas9复合物处理将提取的DNA断裂成300bp

后再环化，加入gRNA和Cas9，含有靶标序列的环形DNA会被切割成线性DNA，再对