细胞免疫荧光染色步骤.docxVIP

免疫荧光（immunofluorescence）染色步骤

调养好细胞状态，于前一晚接种于六孔板，若是用于转染质粒，推荐种植密度为90%~95%，若是干扰片段或者microRNA的mimics等推荐种植30%~50%密度；

铺板后24小时内转染，超过24小时转染效率欠佳，90%~95%密度一般Lip2000加10ul/孔，而30%~50%加5ul/孔，目的基因或片段根据样品说明书决定；

转染24小时后将细胞用胰酶消化，种植于激光共聚焦小皿，若需要拍包膜表达的蛋白，密度可稍微高一点（60%~75%），若普通胞浆或胞核蛋白则密度低一点（20%~40%），很多同学担心铺皿后会被碰翻，有个小技巧可以推荐给大家，将皿置于洁净的六孔板中，对，你没听错，就是常用于细胞转染的六孔板，一方面可以起稳固作用，另一方面六孔板密封性良好，减少污染的可能；

铺皿24小时后，吸去培养基，过滤级PBS清洗2遍；

4%的多聚甲醛固定15min，每个皿200ul~300ul；

过滤级PBS清洗3次，每次5min，可上摇床；

0.5%Triton破膜穿孔，一般胞浆蛋白或胞膜蛋白10min，胞核蛋白13~15min；

过滤级PBS清洗3次，每次5min，可上摇床；

吸净PBS，山羊血清或0.5%BSA封闭30min，个人偏好于用山羊血清封闭；

吸净山羊血清，一抗（5%BSA稀释）4度孵育过夜；

室温静置孵育30min，吸去一抗，过滤级PBS洗3次，可上摇床；

吸去PBS，二抗（5%BSA稀释）室温杂交1小时，从此步起后面所有操作需避光；

吸去二抗，过滤级PBS清洗3次，可上摇床；

吸去PBS，DAPI（甲醇稀释）染色5min；

吸去DAPI，过滤级PBS清洗3次，可上摇床；

上机检测。

如何做免疫荧光共定位？

想同时检测两个蛋白在细胞里的表达，看是否存在共定位现象，以此判断是否有可能存在相互作用。

共定位操作基本与以上步骤一致，需要改变的是如下几步：

步骤10中，需同时加入两种蛋白的一抗，而且必须是不同种属的抗体，比如我抗体A为鼠抗，那么抗体B就不能是鼠抗，常用的是兔抗。

步骤12中，需同时加入两种特异性二抗，而且标记的荧光不能一样，比如加入山羊抗鼠的红光和山羊抗兔的绿光，这样若存在共定位，Merge后会出现黄光。