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脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项

【实验原理】

大分子DNA(一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb之间的DNA片段。

这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb的DNA片段分开。FIGE也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb。

【仪器、材料与试剂】

制备DNA样品所需材料

1TEN缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。

2Seaplaque琼脂糖(EC缓冲液中浓度为2%。

3EC缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/LNaCl；0.5%

4ESP缓冲液(0.5mol/LEDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL蛋白酶K。

5溶葡萄球菌素(5mg/mL。

6RNase(10mg/mL。

胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。

苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL于乙醇中。

90.5μg/mL溴化乙锭

分离、纯化大的DNA片段所需材料

1紫外递质。210mg/mLtRNA。35mol/LNaCl。4苯酚/氯仿。

53mol/LNaAc，pH5.2。695%乙醇。

设备

1TBE缓冲液。

2SeakemHGT琼脂糖。

3WideMini-SubCell凝胶电泳设备。

4变速泵或蠕动泵(Bio-RedLaboratory。5IBIFIJI600HV程序性开关设备。

6缓冲液冷却循环器(Fotodyne，NewBritain，WI或MiniChiller(Bio-RadLaboratory。

【实验步骤】

脉冲电场凝胶电泳的DNA样品的制备

为避免大分子DNA在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcus

aureus作为例子。

取100mL对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g离心5min。

用20mLTEN缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min。之后用10mLEC缓冲液使细胞悬浮。

取1.5mL细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque琼脂糖的EC

缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。

对于每一个菌株，需要15～20个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mLRNase(50mL的10mg/mL的

RNase的10mLEC

缓冲液中，于37℃振摇过夜。

去掉裂解缓冲液，换为10mLESP缓冲液于50℃轻度振摇温育48h。

将凝胶块放在10mL含有174μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF的TE缓冲液中，室温温育4h(2h换液一次，以灭活ESP中的蛋白酶K。

用TE清洗琼脂块6h(2h换液一次，置于TE中4℃保存。

限制酶消化

提高PFGE的分辨率取决于100～1000kb片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。（生物秀实验频道

125μL10×反应缓冲液，30U限制酶，加双蒸水至250μL混匀。

2取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求后，用TE缓冲液洗涤并贮存。

应用PFGE对样品DNA进行分析

用0.5×TBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用WideMinisubCell

进行电泳的话，50mL该溶液即可。

胶凝后，小心移去样品梳。将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，