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氨基酸标样的分析

一、实验目的

（1）熟悉高效液相色谱仪的结构、分离原理和操作程序。

（2）掌握氨基酸标样的分析方法、原理。

二、实验原理

氨基酸与PITC发生反应生成的衍生物，在254nm处有最大吸光值。氨基酸衍生物进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积可进行定性和定量。该方法是柱前衍生法中的一种。PITC方法的反应方程式如下图所示：

三、实验仪器和试剂

1、仪器：

高效液相色谱仪（带紫外检测器）。

2、材料：

氨基酸标样

3、试剂：

衍生液：

异硫氰酸苯酯：甲醇：三乙胺：水（V/V）=1：7：1：1

正己烷、乙腈、乙酸、乙酸钠

以上试剂中乙腈为色谱醇，水为二次蒸馏水，其它为分析醇。

四、实验步骤

1、柱前衍生步骤：

（1）将100ul衍生液加入100ul氨基酸标样或样品中，震荡使混合均匀，室温放置1小时。

（2）反应液中加入200ul正己烷，充分震荡后放置使分层。

（3）取下层溶液用一次性滤膜过滤器（0.45ul）过滤。

（4）取滤液5ul注入HPLC。

2、分离条件的设定

（1）色谱柱：Shim-packVP-ODS4.6mmx15cm

保护柱：Shim-packGVP-ODS4.6mmx1cm

（2）流动相：

A液：0.1M乙酸钠pH6.50（用乙酸调整，500ml乙酸钠中约加2滴乙酸）。

B液：乙腈/水=4/1

（3）流量：1ml/min

柱温：36℃

检测波长：254nm

（4）梯度洗脱程序：

TIME(min)FUNCVALUE

0．01BCONC10

3BCONC10

21BCONC39

21.01BCONC80

25BCONC80

25.01BCONC10

35STOPSTOP

3、数据采集

打开real-timeCSanalysis软件采集数据并对数据进行分析

五、注意事项

1、流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2、流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3、不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

5、气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

6、如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

六、思考题

1、试述反相离子对色谱的分离机理。

2、试述本实验氨基酸分析的基本原理和方法，除了本方法外，还有那些氨基酸分析方法？